本發(fā)明屬于醫(yī)藥，尤其涉及一種結核分枝桿菌融合蛋白lt57構建、表達和純化方法及其應用。

背景技術：

1、結核病(tuberculosis,tb)是一種由結核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis,mtb)引發(fā)的古老疾病，至今仍是世界上主要的致命傳染病之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(world?health?organization,who)的最新數(shù)據(jù)，2022年全球約有1060萬人新發(fā)結核病例，其中約130萬人因結核病而失去生命。及時準確的診斷和治療，對于遏制結核病的蔓延至關重要。為了實現(xiàn)2030年和2035年將結核病發(fā)病率進一步降低的目標，我們需要開發(fā)更短療程和更低毒性的治療方法，改進診斷技術，研發(fā)更有效的疫苗。結核疫苗的接種不僅是控制該疾病最具成本效益的手段，而且能夠從根本上預防結核病的爆發(fā)，是實現(xiàn)全球消除結核病負擔戰(zhàn)略的關鍵環(huán)節(jié)。

2、卡介苗(bacillus?calmette-guérin,bcg)是迄今為止唯一被批準用于預防結核病的疫苗。bcg疫苗主要對兒童的結核性腦膜炎和粟粒性肺結核具有預防效果，而在成人中的保護效力相對較弱。目前，研發(fā)的新型結核疫苗主要包括全細胞減毒活疫苗、全細胞滅活疫苗、病毒載體疫苗和亞單位疫苗等。

3、亞單位疫苗是目前的研究熱點，由mtb的蛋白質(zhì)、多肽、糖脂等具有免疫活性成分物質(zhì)和佐劑組成。相比于活疫苗，其具有成分明確、成本低、產(chǎn)量高、安全性好、制備較容易及質(zhì)量控制好等優(yōu)勢。結核亞單位疫苗中的佐劑能夠促進抗原的緩慢釋放，有助于誘導中央記憶t細胞(central?memory?t?cell，tcm)的形成，為機體提供長期保護。此外，bcg初免后，利用亞單位疫苗強化的方案能夠誘導記憶t細胞(memory?t?cell,tm)介導免疫保護。我們研究發(fā)現(xiàn)bcg抗原mtb10.4和hspx構建的mh在bcg初免后加強2次可以誘導長壽命記憶t細胞介導的免疫。我國人群普遍接種了bcg，亞單位疫苗的加強免疫具有巨大的市場潛力。

4、目前，多種亞單位疫苗已經(jīng)進入臨床試驗階段，包括m72/as01e、gam?tbvac、h56：ic31(aeras-456)、h4：ic31(aeras-404)、id93+gla-se和aec/bc02等。這些疫苗抗原大多集中在mtb細胞壁、分泌表達的抗原等，較少關注mtb的pe/ppe家族抗原。因此，為了提高亞單位疫苗的免疫效果和保護范圍，我們篩選了mtb的pe/ppe家族抗原，聯(lián)合mtb細胞壁抗原構建了融合蛋白pe25-ppe41-rv0518(分子量約為57kda，簡寫為lt57)。

5、pe/ppe蛋白家族主要存在于致病性分枝桿菌中，具有顯著的序列同源性和能夠強烈激活t細胞反應的特異性肽表位。部分pe/ppe蛋白定位在mtb細胞壁，在mtb粘附和侵襲宿主巨噬細胞和對宿主細胞的免疫反應調(diào)節(jié)中起關鍵作用，這些特性使得pe/ppe蛋白家族在疫苗開發(fā)中具有巨大的潛力。pe25和ppe41是成對分泌的pe/ppe家族抗原，在體外細胞模型中，能夠誘導樹突狀細胞的活化和成熟。在小鼠模型中能夠誘導顯著的b細胞反應，促進小鼠淋巴細胞分泌ifn-γ、tnf-α和il-2等細胞因子。

6、mtb的細胞壁具有復雜的抗原，其中包含大量的多糖、糖脂和蛋白質(zhì)等成分。這些抗原在mtb侵入宿主細胞的過程中扮演著至關重要的角色，在誘導機體的體液免疫和細胞免疫應答有重大的意義。篩選出具有優(yōu)勢的mtb細胞壁抗原可以為構建有效的結核疫苗打下堅實的基礎。rv0518是一種mtb細胞壁相關的gdsl脂肪酶，有助于細菌利用甘油/脂質(zhì)進行生長，并通過細胞壁調(diào)節(jié)對各種細胞內(nèi)應激的抵抗力。

7、本發(fā)明利用基因工程的方法將pe/ppe家族抗原pe25、ppe41和細胞壁抗原rv0518在基因水平進行接合，構建了新的融合蛋白lt57，該融合蛋白和佐劑聯(lián)合構建新型結核亞單位疫苗，有望成為有效的結核病候選疫苗。

8、通過上述分析，現(xiàn)有技術存在的問題及缺陷為：

9、bcg疫苗主要對兒童的結核性腦膜炎和粟粒性肺結核具有預防效果，而在成人中的保護效力相對較弱，需開發(fā)新型結核疫苗。

10、已經(jīng)進入臨床試驗階段的多種亞單位疫苗抗原大多集中在mtb細胞壁、分泌表達的抗原等，較少關注mtb的pe/ppe家族抗原。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種結核分枝桿菌融合蛋白lt57構建及其表達純化方法和應用。

2、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種結核分枝桿菌融合蛋白lt57獲得方法：

3、通過基因工程技術將基因pe25、ppe41和rv0518重組入原核表達載體獲得融合蛋白lt57。

4、進一步，表達質(zhì)粒為pet30a，重組表達融合蛋白的質(zhì)粒為：

5、pet30a(+)-lt57(pe25-linker-ppe41-rv0518)。

6、進一步，一種結核分枝桿菌融合蛋白lt57構建及其表達純化方法：

7、步驟1，融合蛋白lt57上清和包涵體均有表達，但以包涵體表達為主。首先將包涵體表達的融合蛋白用尿素變性溶解，使用分子篩柱復性方法進行初步純化；

8、步驟2，分子篩初步純化后，利用離子交換層析qhp柱對含目的蛋白樣本進一步純化，以0-40ms/cm高鹽pb緩沖液洗脫雜蛋白，以40-48ms/cm高鹽pb緩沖液收集目的蛋白。

9、進一步，融合蛋白的使用方式：lt57的單獨使用。

10、進一步，融合蛋白與佐劑共同構成結核亞單位疫苗的應用：使用了dp佐劑。

11、進一步，重組蛋白疫苗在抗結核預防中應用。

12、結合上述的技術方案和解決的技術問題，本發(fā)明所要保護的技術方案所具備的優(yōu)點及積極效果為：

13、第一、本發(fā)明提供新型結核亞單位疫苗融合蛋白lt57的構建、制備和使用方法。采用本發(fā)明所提供融合蛋白與佐劑dp聯(lián)合構成結核亞單位疫苗，可以在小鼠體內(nèi)有效誘導結核抗原特異性的細胞和體液免疫應答反應，同時，該疫苗可以介導小鼠針對減毒株h37ra感染的保護。該疫苗有望成為一種新型的結核亞單位疫苗。

14、本發(fā)明利用基因工程的方法將pe/ppe家族抗原pe25、ppe41和細胞壁抗原rv0518在基因水平進行接合，成功構建、表達和純化了不帶有標簽的結核分枝桿菌融合蛋白lt57，通過分子篩柱復性和離子層析相結合的方法使融合蛋白lt57得到了有效純化。融合蛋白表達穩(wěn)定，純化方法可規(guī)模化制備放大。該融合蛋白和佐劑聯(lián)合構建新型結核亞單位疫苗，在疫苗使用中，融合蛋白lt57取得良好免疫保護效果，具有較好的應用開發(fā)前景。

15、第二，本發(fā)明的技術方案轉化后的預期收益和商業(yè)價值為：

16、本發(fā)明構建的融合蛋白lt57純化方法相對簡單，具有放大生產(chǎn)的潛力，安全性較高，具有良好的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景。此外，融合蛋白lt57聯(lián)合實驗室dp佐抗h37ra感染中，能夠誘導小鼠產(chǎn)生和bcg相近的保護效率，達到提高免疫保護效率的目的，在結核病防治方面具有重要的社會和經(jīng)濟價值，對于其他復雜病原體的疫苗研究也有重要的啟發(fā)意義。

17、本發(fā)明的技術方案填補了國內(nèi)外業(yè)內(nèi)技術空白：已經(jīng)進入臨床試驗階段的m72/as01e、gam?tbvac、h56：ic31(aeras-456)、h4：ic31(aeras-404)、id93+gla-se和aec/bc02等多種亞單位疫苗，抗原大多集中在mtb細胞壁和分泌表達的抗原等，較少關注mtb的pe/ppe家族抗原。

18、本發(fā)明以mtb的pe/ppe家族抗原為主體框架構建融合蛋白lt57，擴大了亞單位疫苗中的抗原豐度，有望成為有效的結核病候選疫苗。