本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種朱頂紅屬caps分子標(biāo)記及其在品種鑒定中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、朱頂紅屬(hippeastrum?spp.)為石蒜科(amaryllidaceae)種球開花植物，花形奇特，具有極高的觀賞價值。朱頂紅起源于美洲亞熱帶地區(qū)，廣泛分布于巴西東部、秘魯、阿根廷和玻利維亞等國家或地區(qū)。該屬的大多數(shù)物種及其雜交品種都有巨大、壯觀的彩色花朵，具有很高的裝飾、觀賞價值。荷蘭、美國、南非等國都進(jìn)行了育種研究，培育出多個品種，用于切花、盆栽和園林觀賞。迄今為止，育種家通過雜交育種等手段已經(jīng)培育出600多個具有商業(yè)價值的品種，且逐年增加。如圖1所示，朱頂紅屬植物的品種鑒定主要依靠花器官的特異性，而在非開花時期很難進(jìn)行品種鑒定。隨著培育的新品種數(shù)量增加，使得朱頂紅的栽培品種、雜交后代和原種的鑒定變得更加困難。這也給朱頂紅的種質(zhì)資源收集與保護(hù)、商業(yè)品種交易與鑒定、品種權(quán)保護(hù)等工作帶來很大的困難。

2、基于不同品種間的dna序列差異開發(fā)的分子標(biāo)記是鑒定朱頂紅品種的有效方法。相較于通過花器官性狀鑒定，利用分子標(biāo)記鑒定朱頂紅品種既不受生長條件、生長時期的影響，同時又具有穩(wěn)定性、可重復(fù)性。單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphism，snp)指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性。snp在全基因組中具有密度高、代表性強、遺傳穩(wěn)定性好的特點；snp標(biāo)記是二等位基因，代表基因組中最小的遺傳變異單元，數(shù)據(jù)統(tǒng)計簡單、準(zhǔn)確；snp的檢測方法靈活多樣，易實現(xiàn)自動化。snp-caps實質(zhì)上是基于snp的pcr技術(shù)與限制性內(nèi)切酶(restriction?endonuclease，re)技術(shù)結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù)，簡單理解就是某snp恰好位于酶切位點上，通過對該snp位點設(shè)計引物，經(jīng)pcr后獲得的相應(yīng)產(chǎn)物片段經(jīng)酶切、電泳等步驟，最終通過觀察不同的條帶判斷樣本的多態(tài)性。目前沒有合適用于鑒定朱頂紅屬的snp-caps分子標(biāo)記，因此，亟需開發(fā)一種分子標(biāo)記，能夠快速、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定地對朱頂紅屬植物進(jìn)行物種鑒定。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本研究通過開發(fā)一套具有ecori酶切位點的snp-caps分子標(biāo)記，依靠不同標(biāo)記的酶切分子指紋圖譜差異對朱頂紅的品種進(jìn)行鑒定，并制作每個品種特有的分子身份證。

2、本發(fā)明第一方面的目的，在于提供一種用于構(gòu)建朱頂紅品種分子身份證的snp分子標(biāo)記。

3、本發(fā)明第二方面的目的，在于提供用于擴(kuò)增本發(fā)明第一方面的snp分子標(biāo)記的引物對。

4、本發(fā)明第三方面的目的，在于提供一種檢測試劑、基因芯片或試劑盒。

5、本發(fā)明第四方面的目的，在于提供本發(fā)明第一方面的snp位點、本發(fā)明第二方面的引物對或本發(fā)明第三方面的檢測試劑、基因芯片或試劑盒的應(yīng)用。

6、本發(fā)明第五方面的目的，在于提供一種朱頂紅品種分子身份證的構(gòu)建方法。

7、本發(fā)明第六方面的目的，在于提供一種朱頂紅品種分子身份證。

8、本發(fā)明第七方面的目的，在于提供一種朱頂紅種質(zhì)、品種鑒定方法。

9、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

10、本發(fā)明的第一個方面，提供一種用于構(gòu)建朱頂紅品種分子身份證的snp分子標(biāo)記，所述snp分子標(biāo)記包括hcaps1、hcaps16、hcaps20、hcaps27、hcaps49、hcaps92、hcaps93、hcaps106、hcaps114、hcaps117、hcaps136、hcaps137、hcaps139、hcaps148、hcaps152、hcaps156、hcaps178、hcaps185、hcaps198和hcaps203，其中，所述hcaps1位于seq?id?no:1所示序列的第312位堿基，堿基為t/a；所述hcaps16位于seq?id?no:2所示序列的第225位堿基，堿基為a/g；所述hcaps20位于seq?id?no:3所示序列的第306位堿基，堿基為a/g；所述hcaps27位于seq?id?no:4所示序列的第226位堿基，堿基為g/c；所述hcaps49位于seq?idno:5所示序列的第259位堿基，堿基為g/a；所述hcaps92位于seq?id?no:6所示序列的第294位堿基，堿基為c/t；所述hcaps93位于seq?id?no:7所示序列的第223位堿基，堿基為g/a；所述hcaps106位于seq?id?no:8所示序列的第255位堿基，堿基為c/t；所述hcaps114位于seqid?no:9所示序列的第392位堿基，堿基為t/a；所述hcaps117位于seq?id?no:10所示序列的第257位堿基，堿基為a/g；所述hcaps136位于seq?id?no:11所示序列的第317位堿基，堿基為g/a；所述hcaps137位于seq?id?no:12所示序列的第345位堿基，堿基為g/a；所述hcaps139位于seq?id?no:13所示序列的第222位堿基，堿基為c/t；所述hcaps148位于seqid?no:14所示序列的第265位堿基，堿基為c/t；所述hcaps152位于seq?id?no:15所示序列的第331位堿基，堿基為a/g；所述hcaps156位于seq?id?no:16所示序列的第263位堿基，堿基為t/c；所述hcaps178位于seq?id?no:17所示序列的第260位堿基，堿基為g/a；所述hcaps185位于seq?id?no:18所示序列的第278位堿基，堿基為g/a；所述hcaps981位于seqid?no:19所示序列的第211位堿基，堿基為t/c；所述hcaps203位于seq?id?no:20所示序列的第231位堿基，堿基為t/g。

11、本發(fā)明的第二個方面，提供用于擴(kuò)增本發(fā)明第一方面的snp分子標(biāo)記的引物對，所述引物對如seq?id?no:21～seq?id?no:60。

12、在本發(fā)明一些實施方式中，seq?id?no:21～seq?id?no:60按順序每兩個核酸序列構(gòu)成一個引物對，分別依次對應(yīng)hcaps1～hcaps203。利用本發(fā)明提供的引物對，制作分子標(biāo)記，可以實現(xiàn)朱頂紅分子身份證的快速構(gòu)建。

13、本發(fā)明的第三個方面，提供包括本發(fā)明第二方面的引物對的檢測試劑、基因芯片或試劑盒。

14、在本發(fā)明一些實施方式中，所述試劑盒還包含dntps、dna聚合酶、pcr反應(yīng)緩沖液、限制性內(nèi)切酶和標(biāo)準(zhǔn)陽性模板中的一種或多種。在本發(fā)明一些實施方式中，所述限制性內(nèi)切酶為ecori內(nèi)切酶。

15、本發(fā)明的第四個方面，提供本發(fā)明第一方面的snp位點、本發(fā)明第二方面的引物對或本發(fā)明第三方面的檢測試劑、基因芯片或試劑盒在(1)～(6)中至少一種中的應(yīng)用：(1)鑒定朱頂紅品種；(2)制備鑒定朱頂紅產(chǎn)品；(3)構(gòu)建朱頂紅品種分子身份證；(4)朱頂紅種質(zhì)親緣關(guān)系鑒定；(5)朱頂紅種質(zhì)資源管理和開發(fā)利用；(6)朱頂紅品種保護(hù)、評價。

16、本發(fā)明的第五個方面，提供一種朱頂紅品種分子身份證的構(gòu)建方法，包括使用本發(fā)明第二方面的引物對或本發(fā)明第三方面的檢測試劑、基因芯片或試劑盒對待測樣品檢測本發(fā)明第一方面的snp分子標(biāo)記的步驟。

17、在本發(fā)明一些實施方式中，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：1)采用本發(fā)明第二方面的引物對或本發(fā)明第三方面的檢測試劑、基因芯片或試劑盒對待測樣品的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；2)分析pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的snp位點基因型，依據(jù)snp位點基因型將各分子標(biāo)記數(shù)字化，按照hcaps1～hcaps203的順序依次排列，串聯(lián)成分子身份證編碼。

18、在本發(fā)明一些實施方式中，所述分析pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的snp位點基因型包括對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切再電泳；或，所述分析pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的snp位點基因型對所述pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

19、在本發(fā)明一些實施方式中，采用限制性內(nèi)切酶酶切pcr擴(kuò)增產(chǎn)物后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行特征條帶的電泳檢測，判斷所述snp位點基因型，根據(jù)基因型將a、t、c、g依次轉(zhuǎn)換為1、2、3、4，缺失位點轉(zhuǎn)換為0，按照hcaps1～hcaps203的順序依次排列，串聯(lián)成分子身份證編碼。

20、本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，分析snp位點堿基類型的方法有很多，包括測序分析、等位基因特異性pcr分析、酶切產(chǎn)物多態(tài)性分析等。

21、在本發(fā)明一些實施方式中，將種質(zhì)資源類別(身份證第一位數(shù)字，如，1代表野生資源(群體)、2代表野生資源(家系)、3代表野生資源(無性系)、4代表地方品種、5代表選育品種、6代表選育品系、7代表遺傳資料)、資源來源區(qū)號(身份證第二至五位，如0031代表原產(chǎn)地為荷蘭)進(jìn)行數(shù)字化，置于在分子身份證編碼(身份證第六至四十五位)之前，形成45位分子身份證編號。

22、在本發(fā)明一些實施方式中，所述限制性內(nèi)切酶為ecori內(nèi)切酶。

23、在本發(fā)明一些實施方式中，所述pcr反應(yīng)體系包括：待測樣本dna?2～3ng/μl，上游引物0.2～0.3μm，下游引物0.2～0.3μm，0.3～0.7μl/μl?2×taq?pcr?starmix，其余為水。

24、在本發(fā)明一些實施方式中，所述pcr反應(yīng)條件為：第一階段94～96℃預(yù)變性4～6min；第二階段93～95℃變性18～22s，53～55℃退火18～22s，71～73℃延伸28～32s，36～42個循環(huán)；第三階段71～73℃再延伸4～6min。

25、在本發(fā)明一些實施方式中，所述酶切反應(yīng)體系包括：pcr擴(kuò)增產(chǎn)物5～15μl/μl，ecori內(nèi)切酶0.05～0.1μl/μl，buffer?0.5～1.5μl/μl。

26、在本發(fā)明一些實施方式中，所述酶切反應(yīng)條件為：33～40℃，2～4h。

27、本發(fā)明的第六個方面，提供一種朱頂紅品種分子身份證，由本發(fā)明第五方面的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。

28、在本發(fā)明一些實施方式中，所述朱頂紅品種分子身份證還包括如下信息：種質(zhì)資源類別、資源來源區(qū)號和/或種質(zhì)資源信息。

29、在本發(fā)明一些實施方式中，所述朱頂紅品種分子身份證的呈現(xiàn)形式包括條形碼和/或二維碼。

30、本發(fā)明的第七個方面，提供一種朱頂紅種質(zhì)、品種鑒定方法，利用本發(fā)明第六方面的朱頂紅品種分子身份證的唯一性確定對應(yīng)的朱頂紅所屬種質(zhì)或品種。

31、本發(fā)明的有益效果是：

32、本發(fā)明提供了一組可用于構(gòu)建朱頂紅品種分子身份證的snp分子標(biāo)記，能夠在分子水平對朱頂紅做出精準(zhǔn)鑒定，理論上根據(jù)該20個snp位點可鑒定共有320＝3,486,784,401種基因型，可滿足復(fù)雜多樣朱頂紅種質(zhì)資源的身份鑒定。

33、本發(fā)明開發(fā)的基于snp分子標(biāo)記的朱頂紅分子身份證，能夠?qū)崿F(xiàn)對不同朱頂紅種質(zhì)身份和親緣關(guān)系的鑒定，為朱頂紅種質(zhì)資源管理和開發(fā)利用、品種保護(hù)及評價提供技術(shù)支持。