本發(fā)明屬于食品保鮮劑制備，具體涉及一種副干酪乳桿菌gy1及其篩選方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、奶制品能為人體提供豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物以及維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而備受青睞。然而，由于奶制品營(yíng)養(yǎng)豐富，使其成為大量細(xì)菌的潛在宿主。其中，金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)則是一種奶制品中常見(jiàn)的典型細(xì)菌，是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，兼性厭氧菌，屬于葡萄球菌屬，形狀呈圓形或卵圓形，其對(duì)干燥、熱力、高鹽和抗生素等具有較強(qiáng)的耐受力，且能產(chǎn)生多種毒素，如腸毒素、溶血毒素和表皮剝脫毒素等，其中腸毒素是引起食物中毒的主要原因，由于高溫處理后腸毒素依舊會(huì)殘留于奶制品中，誤食后會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)多種疾病。另外金黃色葡萄球菌還可引起多種皮膚感染，如癤子、癰和膿皰瘡等，嚴(yán)重危害人體健康。誤食金黃色葡萄球菌感染的食品后，容易導(dǎo)致人體出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等癥狀(molecularmedicalmicrobiology,2,2002,839-888)。

2、近年來(lái)由于抗生素等產(chǎn)品的濫用，金黃色葡萄球菌的耐藥性問(wèn)題日益突出，因此，一種對(duì)金黃色葡萄球菌具有優(yōu)秀抑制性能的抗菌劑產(chǎn)品的出現(xiàn)將有助于緩解當(dāng)前這一現(xiàn)象，對(duì)食品、醫(yī)療等領(lǐng)域具有重要的研究意義。

3、傳統(tǒng)的食品保鮮很大程度上依賴(lài)于化學(xué)防腐劑來(lái)延長(zhǎng)保質(zhì)期(trends?infoodscience&technology,129,2022,421-439),微生物生長(zhǎng)是導(dǎo)致食品腐敗的主要原因，而化學(xué)防腐劑可在一定程度上通過(guò)阻滯微生物生長(zhǎng)而延長(zhǎng)保質(zhì)期。然而，化學(xué)防腐劑不僅危害健康，還會(huì)造成致腐微生物的抗逆性迭代增加，長(zhǎng)期使用則可能造成類(lèi)似“抗生素濫用”，而導(dǎo)致的“無(wú)藥可用”，因此需要尋找新型食品防腐劑。目前，用于食品保鮮的抗菌肽由于其良好的生物安全性而受到了極大的關(guān)注(biomaterialsadvances,155,2023,213684)，抗菌肽具有廣譜性、安全性高以及來(lái)源性廣泛等優(yōu)點(diǎn)，使其在抗菌領(lǐng)域內(nèi)具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值，越來(lái)越成為抗生素等抗菌藥物的新型替代品。經(jīng)研究表明，副干酪乳桿菌可產(chǎn)生抗菌肽對(duì)細(xì)菌，真菌以及病毒都具有廣譜抑菌性(lwt-foodscience?andtechnology,143,2021,111125)，而副干酪乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物中就含有大量的抗菌肽，因此，對(duì)于新型副干酪乳桿菌的發(fā)掘?qū)κ称繁ｕr領(lǐng)域具有重要價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種副干酪乳桿菌gy1及其篩選方法與應(yīng)用，通過(guò)對(duì)桑樹(shù)土壤進(jìn)行篩選，以對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制性能為指標(biāo)所篩選得到的菌株，得到副干酪乳桿菌gy1，再通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中碳源、氮源、ph、溫度以及碳源濃度進(jìn)行優(yōu)化后，副干酪乳桿菌gy1對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率可高達(dá)95％；是一株具有益生潛能的菌株，具有良好的應(yīng)用前景。

2、為解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

3、一種副干酪乳桿菌gy1，其特征在于，所述副干酪乳桿菌gy1分離自桑樹(shù)土壤，于2024年06月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.30931，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，分類(lèi)命名為副干酪乳桿菌 lactobacillus?paracasei，所述副干酪乳桿菌gy1的16s?rdna測(cè)序的核酸序列如seq?idno.1所示。

4、作為改進(jìn)的是，所述副干酪乳桿菌gy1的菌落呈白色、濕潤(rùn)、圓形，直徑0.03～0.1mm，細(xì)胞形態(tài)為短桿狀，長(zhǎng)為3～4.5μm，寬0.3～0.5μm，末端圓滑，屬革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，不產(chǎn)生物胺，不產(chǎn)dnase，自聚集性強(qiáng)，在低于0.4％的膽鹽環(huán)境、低于4％的滲透壓下均具有耐受能力，在模擬胃液或模擬腸液中生長(zhǎng)，耐胃酸。

5、上述副干酪乳桿菌gy1分離自桑樹(shù)土壤，采用梯度稀釋分離法以及牛津杯法，篩選方法包括以下步驟：

6、步驟1，培養(yǎng)基配制

7、mrs液體培養(yǎng)基，lb液體培養(yǎng)基；

8、步驟2，取桑樹(shù)土壤分別接適量于mrs液體培養(yǎng)基和lb液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，培養(yǎng)72h，離心，取上清，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用牛津杯法進(jìn)行初篩，再用含40％的甘油將具有抑菌圈的菌株按體積比1:1保存于-80℃冰箱；

9、步驟3，將菌種從-80℃冰箱中取出，并在mrs和lb固體平板上梯度稀釋后涂布活化，用接種環(huán)挑取單菌落分別接入mrs液體培養(yǎng)基和lb液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，培養(yǎng)3天，離心，取上清，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用牛津杯法進(jìn)行復(fù)篩；

10、步驟4，同步驟3，將-80℃的菌種梯度稀釋涂布于mrs和lb固體平板上進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，確認(rèn)為純菌后，進(jìn)行鑒定。

11、作為改進(jìn)的是，步驟2中離心的速度為5000～12000rpm，離心2～10min；牛津杯法的具體操作為：取10～100μl的上清液，將金黃色葡萄球菌梯度稀釋后，取50～100μl涂布于mrs固體培養(yǎng)基，即可。

12、一種副干酪乳桿菌gy1發(fā)酵液，利用上述的一種副干酪乳桿菌gy1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分離得上清液。

13、作為改進(jìn)的是，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、β-環(huán)糊精、淀粉、木聚糖、木糖、乳糖、殼聚糖、海藻糖和阿拉伯糖，氮源為酵母粉、大豆蛋白、小麥蛋白、蛋白胨、蠶蛹粉和乳清蛋白，ph為3～11，溫度25～40℃，碳源濃度為20～120g/l。

14、進(jìn)一步改進(jìn)的是，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：碳源為蔗糖，氮源為酵母粉，ph為7，溫度37℃，碳源濃度為40g/l時(shí)，所得上清液對(duì)gy1金黃色葡萄球菌抑制活性達(dá)95％及以上。

15、上述副干酪乳桿菌gy1和/或上述一種副干酪乳桿菌gy1發(fā)酵液在抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)上的應(yīng)用。

16、一種食品保鮮劑，包括上述的副干酪乳桿菌gy1和/或上述一種副干酪乳桿菌gy1發(fā)酵液。

17、上述食品保鮮劑在奶制品或肉制品上的應(yīng)用。

18、有益效果

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明一種副干酪乳桿菌gy1及其篩選方法與應(yīng)用，通過(guò)對(duì)桑樹(shù)土壤進(jìn)行篩選，以對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制性能為指標(biāo)所篩選得到的菌株，得到副干酪乳桿菌gy1，其保藏編號(hào)為cgmcc?no.30931，再通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中碳源、氮源、ph、溫度以及碳源濃度進(jìn)行優(yōu)化后，副干酪乳桿菌gy1對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率可高達(dá)95％；且通過(guò)益生實(shí)驗(yàn)，確定了副干酪乳桿菌gy1是一株具有益生潛能的菌株，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種副干酪乳桿菌gy1，其特征在于，所述副干酪乳桿菌gy1分離自桑樹(shù)土壤，于2024年06月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.30931，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，分類(lèi)命名為副干酪乳桿菌lactobacillus?paracasei，所述副干酪乳桿菌gy1的16s?rdna測(cè)序的核酸序列如seq?idno.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副干酪乳桿菌gy1，其特征在于，所述副干酪乳桿菌gy1的菌落呈白色、濕潤(rùn)、圓形，直徑0.03~0.1?mm，細(xì)胞形態(tài)為短桿狀，長(zhǎng)為3~4.5?μm，寬0.3~0.5?μm，末端圓滑，屬革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，不產(chǎn)生物胺，不產(chǎn)dnase，自聚集性強(qiáng)，在低于0.4%的膽鹽環(huán)境、低于4%的滲透壓下均具有耐受能力，在模擬胃液或模擬腸液中生長(zhǎng)，耐胃酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副干酪乳桿菌gy1，其特征在于，所述副干酪乳桿菌gy1分離自桑樹(shù)土壤，采用梯度稀釋分離法以及牛津杯法，篩選方法包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的副干酪乳桿菌gy1，其特征在于，步驟2中離心的速度為5000~12000?rpm，離心2~10?min；牛津杯法的具體操作為：取10~100?μl的上清液，將金黃色葡萄球菌梯度稀釋后，取50~100?μl涂布于mrs固體培養(yǎng)基，即可。

5.一種副干酪乳桿菌gy1發(fā)酵液，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的一種副干酪乳桿菌gy1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分離得上清液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種副干酪乳桿菌gy1發(fā)酵液，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、β-環(huán)糊精、淀粉、木聚糖、木糖、乳糖、殼聚糖、海藻糖和阿拉伯糖，氮源為酵母粉、大豆蛋白、小麥蛋白、蛋白胨、蠶蛹粉和乳清蛋白，ph為3~11，溫度25~40℃，碳源濃度為20~120?g/l。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種副干酪乳桿菌gy1發(fā)酵液，其特征在于，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：碳源為蔗糖，氮源為酵母粉，ph為7，溫度37℃，碳源濃度為40?g/l時(shí)，所得上清液對(duì)gy1金黃色葡萄球菌抑制活性達(dá)95%及以上。

8.基于權(quán)利要求1-4所述的副干酪乳桿菌gy1和/或權(quán)利要求5-7所述的一種副干酪乳桿菌gy1發(fā)酵液在抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)上的應(yīng)用。

9.一種食品保鮮劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1-4所述的副干酪乳桿菌gy1和/或權(quán)利要求5-7所述的一種副干酪乳桿菌gy1發(fā)酵液。

10.基于權(quán)利要求9所述的食品保鮮劑在奶制品或肉制品上的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種副干酪乳桿菌GY1及其篩選方法與應(yīng)用。該菌為通過(guò)從桑樹(shù)土壤樣品中分離篩到的副干酪乳桿菌GY1，保藏編號(hào)為CGMCC?No.30931，于2024年06月11日中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，分類(lèi)命名為副干酪乳桿菌Lactobacillus?paracasei；是一株安全且具有良好益生潛能的菌株，其16S?rDNA測(cè)序的核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。通過(guò)對(duì)所篩菌株的培養(yǎng)條件的優(yōu)化，所得上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率高于95%，為奶制品等食品保鮮領(lǐng)域提供了一種新的思路，具有良好的市場(chǎng)前景。

技術(shù)研發(fā)人員：宮璐嬋,雷正艷,沈凱慧,李婷婷,羅冰冰,趙耀,凌旭圓,王俊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30