本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及過表達(dá)abmyb93蛋白在促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成中的應(yīng)用和方法。

背景技術(shù)：

1、顛茄(atropa?belladonna)是茄科多年生草本植物，全株均可入藥，是藥用托品烷生物堿(tropane?alkaloids,tas)的主要來源之一。托品烷生物堿是一類植物天然次生代謝產(chǎn)物，主要代表有莨菪堿、東莨菪堿以及山莨菪堿。研究發(fā)現(xiàn)托品烷生物堿具有很好的抗膽堿作用，因此被廣泛應(yīng)用于麻醉、抗暈動、治療帕金森等方面，是非常重要的臨床藥物，具有巨大的市場需求。但野生型顛茄中的托品烷生物堿產(chǎn)量非產(chǎn)低，所以利用相關(guān)生物技術(shù)手段來培育高產(chǎn)tas的顛茄種質(zhì)資源可以有效解決托品烷生物堿藥物資源短缺問題。

2、油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids，br)是一種新型植物內(nèi)源激素，對植物次生代謝具有重要作用。已有大量研究揭示了br對次生代謝產(chǎn)物生物合成的影響。myb轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物次生代謝產(chǎn)物生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。myb家族轉(zhuǎn)錄因子已被報道參與了br信號傳導(dǎo)，從而參與次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。過表達(dá)gmmyb14的大豆中內(nèi)源br含量降低，而外源施用油菜素內(nèi)酯能部分挽救過表達(dá)gmmyb14大豆的表型，并且發(fā)現(xiàn)gmmyb14能直接結(jié)合到gmben1的啟動子上并上調(diào)其表達(dá)，導(dǎo)致過表達(dá)gmmyb14大豆中br含量降低；并且在gmmyb14過表達(dá)的大豆植物中，黃酮類、異黃酮類和木質(zhì)素生物合成基因表達(dá)水平上調(diào)(chen?et?al.,2020)。在蘋果中響應(yīng)br誘導(dǎo)的myb轉(zhuǎn)錄因子mdmyb60，參與了對類黃酮生物合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用(wang?et?al.,2021)。

3、目前，顛茄中的托品烷生物堿的生物合成途徑雖已被完整解析，但對其中復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制仍處于研究階段。因此，探究br對托品烷生物堿生物合成的影響，并鑒定出其中的關(guān)鍵調(diào)控因子，為托品烷生物堿代謝工程提供有效的功能基因，對進(jìn)一步豐富顛茄中托品烷生物堿生物合成代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種過表達(dá)abmyb93蛋白在促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成中的應(yīng)用；本發(fā)明目的之二在于提供與所述abmyb93蛋白相關(guān)的生物材料在促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之三在于提供一種過表達(dá)abmyb93基因促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成的方法。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、1、一種過表達(dá)abmyb93蛋白在促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成中的應(yīng)用，所述abmyb93蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.7所示。

4、在本發(fā)明的一些實施例中，編碼abmyb93蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

5、在本發(fā)明的一些實施例中，所述托品烷生物堿為莨菪堿、東莨菪堿或山莨菪堿。

6、在本發(fā)明的一些實施例中，所述abmyb93蛋白屬于myb轉(zhuǎn)錄因子家族，其受br誘導(dǎo)，可以直接與靶標(biāo)基因啟動子pmpo(-430～-1)中-97、ptri(-1281～-801)中-966和phdh(-719～-270)中-504處的myb結(jié)合基序特異性結(jié)合而發(fā)揮作用，所述pmpo(-430～-1)、ptri(-1281～-801)、phdh(-719～-270)的核苷酸序列如seq?id?no.1～3所示。

7、2、與所述abmyb93蛋白相關(guān)的生物材料在促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成中的應(yīng)用，其特征在于，所述abmyb93蛋白相關(guān)的生物材料包括編碼abmyb93蛋白的核酸分子，或含有編碼abmyb93蛋白的核酸分子的表達(dá)盒或重組載體，或含有編碼abmyb93蛋白的核酸分子、編碼abmyb93蛋白的核酸分子的表達(dá)盒或重組載體的微生物細(xì)胞。

8、3、一種過表達(dá)abmyb93基因促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成的方法，包含如下步驟：

9、構(gòu)建abmyb93基因過表達(dá)載體，然后在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化顛茄葉片，篩選獲得托品烷生物堿含量提高的轉(zhuǎn)基因毛狀根；編碼所述abmyb93基因的氨基酸序列如seq?id?no.7所示。

10、在本發(fā)明的一些實施例中，所述abmyb93基因過表達(dá)載體為將seq?id?no.6所示核酸序列構(gòu)建到pg2質(zhì)粒的bgl?ii和bsteii位點(diǎn)之間所得，所述pg2質(zhì)粒為使用xhol將pcambia1305.1中的潮霉素抗性基因替換為新型抗草甘膦基因g2-epsps構(gòu)建而成。

11、在本發(fā)明的一些實施例中，所述農(nóng)桿菌為c58c1菌株。

12、在本發(fā)明的一些實施例中，托品烷生物堿為莨菪堿、東莨菪堿或山莨菪堿。

13、本發(fā)明的有益效果在于：通過對顛茄毛狀根進(jìn)行br處理以及生物信息學(xué)分析，首次鑒定出顛茄中能夠受到br誘導(dǎo)且調(diào)控顛茄中tas的生物合成的轉(zhuǎn)錄因子abmyb93，并利用相關(guān)分子生物學(xué)和生物化學(xué)等手段解析了abmyb93調(diào)控顛茄tas生物合成過程中的具體機(jī)制，為托品烷生物堿代謝工程提供了有效的功能基因，并為獲取在br下能夠高產(chǎn)tas的顛茄種質(zhì)資源提供新思路。

技術(shù)特征：

1.一種過表達(dá)abmyb93蛋白在促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成中的應(yīng)用，其特征在于，所述abmyb93蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.7所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，編碼abmyb93蛋白的核苷酸序列如seq?idno.6所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述托品烷生物堿為莨菪堿、東莨菪堿或山莨菪堿。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述abmyb93蛋白屬于myb轉(zhuǎn)錄因子家族，其受br誘導(dǎo)，可以直接與靶標(biāo)基因啟動子pmpo(-430～-1)中-97、ptri(-1281～-801)中-966和phdh(-719～-270)中-504處的myb結(jié)合基序特異性結(jié)合而發(fā)揮作用，所述pmpo(-430～-1)、ptri(-1281～-801)、phdh(-719～-270)的核苷酸序列如seq?id?no.1～3所示。

5.與權(quán)利要求1中所述abmyb93蛋白相關(guān)的生物材料在促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成中的應(yīng)用，其特征在于，所述abmyb93蛋白相關(guān)的生物材料包括編碼abmyb93蛋白的核酸分子，或含有編碼abmyb93蛋白的核酸分子的表達(dá)盒或重組載體，或含有編碼abmyb93蛋白的核酸分子、編碼abmyb93蛋白的核酸分子的表達(dá)盒或重組載體的微生物細(xì)胞。

6.一種過表達(dá)abmyb93基因促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成的方法，其特征在于，包含如下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述abmyb93基因過表達(dá)載體為將seq?idno.6所示核酸序列構(gòu)建到pg2質(zhì)粒的bgl?ii和bsteii位點(diǎn)之間所得，所述pg2質(zhì)粒為使用xhol將pcambia1305.1中的潮霉素抗性基因替換為新型抗草甘膦基因g2-epsps構(gòu)建而成。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌為c58c1菌株。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，托品烷生物堿為莨菪堿、東莨菪堿或山莨菪堿。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了過表達(dá)AbMYB93蛋白在促進(jìn)顛茄托品烷生物堿合成中的應(yīng)用和方法，屬于植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，所述AbMYB93蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示，通過構(gòu)建AbMYB93基因過表達(dá)載體，然后在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化顛茄葉片，篩選獲得托品烷生物堿含量提高的轉(zhuǎn)基因毛狀根，過表達(dá)AbMYB93轉(zhuǎn)基因毛狀根株系與對照相比，莨菪堿提高了了1.92～2.43倍、山莨菪堿提高了1.45～2.01倍、東莨菪堿提高了1.53～2.22倍；以上結(jié)果表明AbMYB93可以促進(jìn)顛茄中TAs含量的積累，是顛茄中TAs生物合成的正調(diào)控因子。

技術(shù)研發(fā)人員：廖志華,陳敏,李旭鋒,茍玉琴,張芳源,曾令江,楊春賢
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西部（重慶）科學(xué)城種質(zhì)創(chuàng)制大科學(xué)中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10