本發(fā)明涉及蛋白質合成，具體涉及一種膜結合磷酸糖基轉移酶的無細胞表達方法。

背景技術：

1、微生物胞外多糖不僅有助于細胞間的相互吸附和識別作用、對外界極端環(huán)境的應激反應、吸附外源有機或無機化合物；更重要的是，胞外多糖的優(yōu)良流變性、乳化性和絮凝活性，賦予了其免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等特殊的生物活性。因此，微生物胞外多糖重要的醫(yī)學價值和工業(yè)用途引起了人們的廣泛關注。

2、微生物胞外多糖及糖綴合物(糖脂、糖蛋白)的生物合成依賴于磷酸糖基轉移酶來啟動糖重復單元或糖綴合物前體的組裝。在磷酸糖基轉移酶的作用下，糖核苷酸和脂載體(und-p)形成und-pp-糖。磷酸糖基轉移酶分為兩個家族：聚異戊二烯基磷酸n-乙酰氨基糖-1-磷酸轉移酶(pnpt)和聚異戊二烯基磷酸己糖-1-磷酸轉移酶(phpt)。然而，由于磷酸糖基轉移酶是一種整合膜蛋白，其疏水結構域使其難以在大腸桿菌等生物體內過表達，如何獲得純度高、穩(wěn)定性好的膜蛋白仍然是表征磷酸糖基轉移酶的重大挑戰(zhàn)，一定程度上限制了研究人員對微生物胞外多糖生物合成機制的解析和對糖分子組成的調控。

3、傳統(tǒng)膜結合磷酸糖基轉移酶表達方法是通過融合分子伴侶或sumo、trxa等促溶標簽于大腸桿菌等胞內表達體系進行表達(protein?expression?and?purification?207(2023)106273、glycobiology,2012,22(1):116–122)，而后使用ddm、triton?x-100、chaps等系列表面活性劑從膜中提取或重構胞內表達的不溶性蛋白沉淀(journal?ofbiological?chemis?try,2023,299(10):105194、antimicrobial?agents?andchemotherapy,2017,61(11):e01310-17、mbio,2023,14(5):e00948-23.)，從而將其溶解至洗滌劑膠束中，獲得可溶性蛋白樣品。盡管如此，目前對膜結合磷酸糖基轉移酶的功能研究與晶體結構解析仍然非常困難。這主要是由于膜蛋白過表達易引起細胞毒性，其表達量及純度尚未達到結構分析的要求；而且并非所有的表面活性劑所形成的膠束均能在體外重構或在體內提取磷酸糖基轉移酶，并使其具備相應功能活性，這一過程仍需對促溶標簽或表面活性劑進行冗雜的篩選與優(yōu)化過程。因此，傳統(tǒng)研究手段對實現(xiàn)膜結合磷酸糖基轉移酶的功能性表達尚存在明顯的局限性，亟需尋找一種實現(xiàn)膜結合磷酸糖基轉移酶可溶性表達的高效方法。

4、近年來，隨著合成生物技術的進步，基于細胞提取物的無細胞蛋白合成(cell-free?protein?synthesis，cfps)系統(tǒng)成為有望替代胞內系統(tǒng)的開放式蛋白質表達系統(tǒng)，在外源補充能量體系、氨基酸、輔因子、基因模板等必須物質的情況下可于體外實現(xiàn)中心法則，控制基因轉錄與蛋白質翻譯，數(shù)小時內即可實現(xiàn)目標蛋白的高效合成。與傳統(tǒng)的基于胞內的表達體系相比，cfps不僅操作簡便、效率高，還突破了蛋白合成與細胞活性之間關系的瓶頸，為膜蛋白的功能性表達提供了一種新的途徑。

5、目前，基于表面活性劑的模式(detergent?based?cell-free，dcf)和基于脂質的模式(lipid?based?cell-free，lcf)以被應用于cfps系統(tǒng)中表達膜蛋白，使目的膜蛋白以可溶形式與膠束或脂質體共翻譯。dcf模式在組裝cfps反應體系時直接補充表面活性劑，膜蛋白可利用其形成的膠束穩(wěn)定其疏水結構域；而lcf模式則補充納米脂質體、納米磷脂盤等脂質膜組件，使膜蛋白疏水結構域整合于磷脂雙分子層結構中。friederike?junge于無細胞體系中補充0.5％brij35，以dcf模式成功獲得內皮素受體a的可溶性蛋白樣品(journalof?structural?biology,2010,172(1):94–106)；ke?yue則制備了一種脂質體，以lcf模式實現(xiàn)水通道蛋白aqpz的可溶性表達(cells,2019,8(11):1325.)；michael?c.jewett團隊以ddm、triton?x-100以及popc納米磷脂盤作為人工疏水材料，以dcf或lcf模式于cfps系統(tǒng)中獲得可溶性寡糖基轉移酶cjpglb(biotechnology?and?bioengineering,2018,115(3):739–750.)。

6、然而，目前使用cfps系統(tǒng)制備磷酸糖基轉移酶的研究鮮有報道。這主要是由于cfps系統(tǒng)中缺乏生物膜環(huán)境，還需針對磷酸糖基轉移酶這一特定蛋白進行膜增強型系統(tǒng)改造。此外，不同膜蛋白的理化性質差異導致其最適疏水材料的不同，加之商業(yè)化納米磷脂盤的成本較高，限制了該技術在磷酸糖基轉移酶體外制備的進一步應用。

7、因此，篩選合適的疏水材料，并建立適用于膜結合磷酸糖基轉移酶可溶性表達的無細胞蛋白合成系統(tǒng)至關重要。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發(fā)明的目的在于提供一種膜結合磷酸糖基轉移酶的無細胞表達方法，解決目前膜結合磷酸糖基轉移酶合成過程中表達效率較低、溶解性能不佳、難以折疊成活性口袋系列難題。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的實施例在提出了一種膜結合磷酸糖基轉移酶的無細胞表達方法，其包括以下步驟：

3、構建含編碼膜結合磷酸糖基轉移酶基因gtp或epsl的重組質粒；

4、制備納米脂質體；

5、制備大腸桿菌rosetta(de3)細胞提取物；

6、將所述重組質粒加入到包含所述大腸桿菌rosetta(de3)細胞提取物、反應緩沖液的無細胞表達體系中，同時將表面活性劑或納米脂質體作為人工疏水材料補充至所述無細胞表達體系，混勻后至于20～30℃恒溫搖床中孵育8～12h，以實現(xiàn)gtp或epsl膜結合磷酸糖基轉移酶的高效可溶性表達。

7、根據(jù)本發(fā)明實施例的一種膜結合磷酸糖基轉移酶的無細胞表達方法，以基于大腸桿菌rosetta(de3)細胞提取物的膜增強型無細胞系統(tǒng)作為重要蛋白合成平臺，數(shù)小時內即可于1.5ml?ep管中實現(xiàn)膜結合磷酸糖基轉移酶gtp、epsl的可溶性表達，大大減少了獲得膜結合磷酸糖基轉移酶的時間成本、簡化了其生產(chǎn)工藝，有效避免傳統(tǒng)方法表達過程繁瑣、表達量低等問題，不僅為膜蛋白的高效可溶性表達提供了新方法，也為膜結合磷酸糖基轉移酶的晶體結構解析與功能研究奠定了基礎。

8、另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例提出的一種膜結合磷酸糖基轉移酶的無細胞表達方法，還可以具有如下附加的技術特征：

9、可選地，膜結合磷酸糖基轉移酶gtp的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；膜結合磷酸糖基轉移酶epsl的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

10、可選地，構建含編碼膜結合磷酸糖基轉移酶基因gtp或epsl的重組質粒的步驟為：

11、以地衣芽孢桿菌cgmcc?2876基因組為模板，pcr擴增膜結合磷酸糖基轉移酶基因gtp、膜結合磷酸糖基轉移酶基因epsl，將pcr擴增產(chǎn)物與線性化pivex?2.4c載體通過gibson組裝進行連接，轉化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞中，篩選重組子進行測序，獲得pivex2.4c-gtp重組質粒、pivex2.4c-epsl重組質粒。

12、進一步，pcr擴增膜結合磷酸糖基轉移酶基因gtp使用的引物如seq?id?no.3、seqidno.4所示；pcr擴增膜結合磷酸糖基轉移酶基因epsl使用的引物如seq?id?no.5、seqidno.6所示。

13、可選地，所述納米脂質體的制備包括：

14、將磷脂和膽固醇溶解于有機溶劑中，通過旋轉蒸發(fā)形成脂質薄膜，去除有機溶劑后加入磷酸鹽緩沖液，于45℃下攪拌水合1h，收集脂質懸液后，立即通過超聲能量和機械能的聯(lián)合作用減小脂質體粒徑，獲得納米脂質體。

15、進一步，所述有機溶劑為氯仿和甲醇，比例為3:1；所述磷脂和所述膽固醇的比例為4:1；所述磷酸鹽緩沖液加入量為：每20mg磷脂加入1ml磷酸鹽緩沖液。

16、進一步，通過超聲能量和機械能的聯(lián)合作用為：使用20％的功率，超聲10min后立即通過含100～200nm聚碳酸酯膜的脂質體擠出機21～31次。

17、可選地，所述反應緩沖液的組分為hepes、atp、ctp、gmp、ump、輔酶a、trna、亞葉酸、亞精胺、谷氨酸鉀、谷氨酸鎂、二硫蘇糖醇、三磷酸甘油酸、多種氨基酸、煙酰胺二核苷酸、peg6000。

18、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。