本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用 vdufgt基因過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法。

背景技術(shù)：

1、植物次生代謝產(chǎn)物是由次生代謝產(chǎn)生的小分子有機(jī)化合物，是植物最主要的活性物質(zhì)之一，其中，花青素屬于類黃酮化合物，花青素可與糖類以糖苷鍵結(jié)合形成花色苷從而更穩(wěn)定的存在于植物的各個(gè)器官中，進(jìn)而呈現(xiàn)出紅色、紫色、藍(lán)色等顏色特征，花青素不僅對(duì)植物生長(zhǎng)和生命活動(dòng)具有重要的作用，還在人類健康中扮演重要的角色，花青素具有強(qiáng)抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抑制炎癥、改善視力等，植物源天然花青素安全、無(wú)毒，在食品和化妝產(chǎn)業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。

2、花青素存在于植物的根、莖、葉、花和果實(shí)中，目前主要的利用來(lái)源也是從植物中提取，其中植物果實(shí)是花青素最重要的獲取途徑之一，但是隨著水果種植成本的不斷上升，鮮果的售價(jià)也在不斷上漲，這嚴(yán)重阻礙了果實(shí)花青素的開(kāi)發(fā)利用。此外，植物源天然產(chǎn)物的利用面臨來(lái)源混雜、品質(zhì)不一，具有季節(jié)性，受環(huán)境影響大，還存在提取前處理復(fù)雜、步驟繁瑣、資源浪費(fèi)、環(huán)境破壞等問(wèn)題。鑒于此，本申請(qǐng)采用基因工程手段構(gòu)建花青素高產(chǎn)細(xì)胞系，并進(jìn)一步基于細(xì)胞工程的植物工廠進(jìn)行花青素生產(chǎn)研究，該方法人為可控，不受季節(jié)環(huán)境影響，可周年生產(chǎn)，生態(tài)友好。

3、植物花青素的合成首先通過(guò)莽草酸途徑合成苯丙氨酸，再通過(guò)苯丙烷途徑合成4-香豆酰-coa，隨后進(jìn)入類黃酮和花青素代謝途徑。類黃酮到花青素合成經(jīng)歷多個(gè)關(guān)鍵酶的作用，其中 ufgt具有催化花青素形成花青素苷的作用，從而使花青素更穩(wěn)定的存在于植物細(xì)胞液泡中。

4、本發(fā)明人通過(guò)刺葡萄細(xì)胞 ufgt的過(guò)表達(dá)，擬構(gòu)建獲得花青素高產(chǎn)刺葡萄細(xì)胞系，結(jié)合基因工程和細(xì)胞工程的手段通過(guò)植物工廠進(jìn)行花青素生產(chǎn)，為植物天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用尋求一條高效的替代方案以解決目前植物源天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用存在的成本高、效率低、受環(huán)境、季節(jié)影響的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題，在于提供一種利用 vdufgt基因過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法，實(shí)現(xiàn)了植物細(xì)胞工廠花青素高效生產(chǎn)，具有成本低、周期短、效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，不受季節(jié)環(huán)境影響可周年生產(chǎn)。

2、本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

3、一種利用 vdufgt基因過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法，采用 vdufgt基因進(jìn)行刺葡萄細(xì)胞自體遺傳轉(zhuǎn)化，使 vdufgt基因過(guò)量表達(dá)，構(gòu)建 vdufgt過(guò)表達(dá)刺葡萄細(xì)胞系，促進(jìn)花青素積累，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠花青素生產(chǎn)。

4、進(jìn)一步地，包括 ufgt基因在內(nèi)的多個(gè)花青素合成關(guān)鍵基因呈上調(diào)表達(dá)，同時(shí)多種類黃酮代謝產(chǎn)物顯著上調(diào)積累，其中花青素、黃酮的含量顯著提升。

5、進(jìn)一步地，具體步驟包括 vdufgt基因植物表達(dá)載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、過(guò)表達(dá)細(xì)胞系篩選與鑒定、細(xì)胞工廠的花青素生產(chǎn)。

6、進(jìn)一步地，所述 vdufgt基因來(lái)源于刺葡萄，通過(guò)酶切連接或者同源重組構(gòu)建 vdufgt-gfp植物表達(dá)載體；具體為： vdufgt基因刺葡萄，通過(guò)酶切-連接或者同源重組的方法將去除終止密碼子的目的基因構(gòu)建到pbi121中，經(jīng)菌落pcr和測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建 vdufgt-gfp重組質(zhì)粒。

7、進(jìn)一步地，所述遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化刺葡萄細(xì)胞，刺葡萄細(xì)胞的農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為10-12?min，共培養(yǎng)60~72h，于抗性培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選；

8、進(jìn)一步地，所述過(guò)表達(dá)細(xì)胞系通過(guò)抗性篩選，采用熒光信號(hào)檢測(cè)和dna-pcr法鑒定ufgt-gfp轉(zhuǎn)化， ufgt的表達(dá)量顯著提升，促進(jìn)花青素合成積累；具體為:抗性愈傷組織細(xì)胞系首先采用手提式便攜熒光激發(fā)光源進(jìn)行g(shù)fp綠色熒光檢測(cè)，再通過(guò)提取dna作為模板，通過(guò)pcr法鑒定，獲得ufgt-gfp陽(yáng)性細(xì)胞系；對(duì)獲得的陽(yáng)性細(xì)胞系進(jìn)行增殖系數(shù)統(tǒng)計(jì)和花青素含量測(cè)定，篩選獲得高花青素產(chǎn)量的 vdufgt過(guò)表達(dá)細(xì)胞系。

9、采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、熒光定量pcr和花青素含量測(cè)定驗(yàn)證 ufgt過(guò)表達(dá)細(xì)胞系關(guān)鍵基因和產(chǎn)物的表達(dá)積累特征。

10、進(jìn)一步地，為實(shí)現(xiàn)花青素細(xì)胞工廠大量生產(chǎn)，構(gòu)建花青素細(xì)胞工廠；所述花青素細(xì)胞工廠采用液體懸浮細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行，細(xì)胞大量擴(kuò)增和花青素高效合成，培養(yǎng)基為ms基本培養(yǎng)基，附加1.0?mg/l?2,4-d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，轉(zhuǎn)速為120-150?rpm。

11、本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

12、（1）本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了植物細(xì)胞工廠花青素高效生產(chǎn)。過(guò)表達(dá)刺葡萄細(xì)胞系中花青素合成關(guān)鍵基因 ufgt表達(dá)水平顯著提升，促進(jìn)上游基因表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)花青素合成積累，篩選獲得花青素高產(chǎn)細(xì)胞系，結(jié)合液體懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，構(gòu)建了花青素合成細(xì)胞工廠。

13、（2）本發(fā)明解決了天然植物花青素提取存在的植物資源浪費(fèi)、材料前處理困難、成本高、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、受季節(jié)和環(huán)境影響大等問(wèn)題；本發(fā)明可使花青素產(chǎn)量提高8.5倍，產(chǎn)量達(dá)到3.17%，花青素生產(chǎn)周期可以縮短至12天，具有成本低、周期短、效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，不受季節(jié)環(huán)境影響可周年生產(chǎn)，為天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用提供了新的視角。

技術(shù)特征：

1.一種利用vdufgt基因過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法，其特征在于：采用vdufgt基因進(jìn)行刺葡萄細(xì)胞自體遺傳轉(zhuǎn)化，使vdufgt基因過(guò)量表達(dá)，構(gòu)建vdufgt過(guò)表達(dá)刺葡萄細(xì)胞系，促進(jìn)花青素積累，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠花青素生產(chǎn)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用vdufgt基因過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法，其特征在于：包括ufgt基因在內(nèi)的多個(gè)花青素合成關(guān)鍵基因呈上調(diào)表達(dá)，同時(shí)多種類黃酮代謝產(chǎn)物顯著上調(diào)積累。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用vdufgt基因過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法，其特征在于：具體步驟包括vdufgt基因植物表達(dá)載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、過(guò)表達(dá)細(xì)胞系篩選與鑒定、細(xì)胞工廠的花青素生產(chǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用vdufgt基因過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法，其特征在于：所述vdufgt基因來(lái)源于刺葡萄，通過(guò)酶切連接或者同源重組構(gòu)建vdufgt-gfp植物表達(dá)載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用vdufgt基因過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法，其特征在于：所述遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，刺葡萄細(xì)胞的農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為10-12min，共培養(yǎng)60～72h，于抗性培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用vdufgt基因過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法，其特征在于：所述過(guò)表達(dá)細(xì)胞系通過(guò)抗性篩選，采用熒光信號(hào)檢測(cè)和dna-pcr法鑒定ufgt-gfp轉(zhuǎn)化，獲得ufgt-gfp陽(yáng)性細(xì)胞系；對(duì)獲得的陽(yáng)性細(xì)胞系進(jìn)行增殖系數(shù)統(tǒng)計(jì)和花青素含量測(cè)定，篩選獲得高花青素產(chǎn)量的vdufgt過(guò)表達(dá)細(xì)胞系。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用vdufgt基因過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法，其特征在于：所述花青素細(xì)胞工廠采用液體懸浮細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行，細(xì)胞大量擴(kuò)增和花青素高效合成，培養(yǎng)基為ms基本培養(yǎng)基，附加1.0mg/l?2,4-d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，轉(zhuǎn)速為120-150rpm。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用VdUFGT過(guò)表達(dá)構(gòu)建花青素植物細(xì)胞工廠的方法，將克隆的刺葡萄VdUFGT基因進(jìn)行自體遺傳轉(zhuǎn)化，獲得VdUFGT高表達(dá)和花青素高產(chǎn)細(xì)胞系，該細(xì)胞系顯著提高花青素生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花青素等代謝產(chǎn)物的積累，結(jié)合細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，構(gòu)建高產(chǎn)花青素植物細(xì)胞工廠。本發(fā)明可使花青素產(chǎn)量提高8.5倍，產(chǎn)量達(dá)到3.17％，花青素生產(chǎn)周期可以縮短至12天，具有成本低、周期短、效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)天然花青素規(guī)模化周年不間斷生產(chǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：賴恭梯,賴呈純
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30