本發(fā)明涉及免疫檢測，尤其是指一種特異性結(jié)合腸毒素sec的抗原結(jié)合蛋白對及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aureus，s.aureus)是常見的食源性致病菌，廣泛存在于自然環(huán)境中。其在適當(dāng)?shù)臈l件下，能夠產(chǎn)生腸毒素，引起食物中毒。s.aureus引發(fā)的食物中毒報道層出不窮，由s.aureus引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，而且s.aureus已經(jīng)成為僅次于沙門氏菌和副溶血性弧菌的第三大食源性致病菌。s.aureus分泌的腸毒素是一種單鏈小分子蛋白，分子量約26-29kda，具有熱穩(wěn)定性，對人體腸道產(chǎn)生破壞，導(dǎo)致嘔吐腹瀉等癥狀。常見的腸毒素主要包括sea、seb、sec、sed、see。

2、目前用于金黃色葡萄球菌檢測的方法主要有傳統(tǒng)分離鑒定方法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法。其中傳統(tǒng)分離鑒定方法通常包括平板劃線和生化鑒定。分子生物學(xué)檢測方法通常包括pcr、核酸探針技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(lamp)。免疫學(xué)檢測方法通常包括elisa、免疫磁珠法、免疫層析試紙條、生物傳感技術(shù)等。

3、抗體是免疫檢測的核心試劑，傳統(tǒng)單克隆抗體的獲取需經(jīng)過小鼠免疫、雜交瘤細胞融合、單克隆篩選、細胞擴培和腹水生產(chǎn)等制備過程。傳統(tǒng)單克隆抗體有以下局限性：在雜交瘤細胞的凍存、復(fù)蘇和傳代過程中，會出現(xiàn)抗體基因漂變或丟失的現(xiàn)象，導(dǎo)致單克隆抗體性能下降；在腹水生產(chǎn)過程中，由于小鼠個體有差異，會出現(xiàn)溶血的現(xiàn)象，從而影響抗體的質(zhì)量；另外，雜交瘤細胞的長期保存十分依賴液氮，需隨時補充，保存成本高。基于基因工程技術(shù)的重組抗體可以規(guī)避這些局限，相比傳統(tǒng)腹水法制備的抗體，重組抗體的優(yōu)勢在于：可重復(fù)性，抗體基因的信息可以永久保持，不會丟失，具有準(zhǔn)確性和批間一致性；可重塑性，通過基因重組的方式可以改變抗體的種類或亞型，也可以增強抗體的性能；無需使用實驗動物，減少對動物的傷害；純度高，重組抗體是在無血清條件下表達的，避免血清成分污染?，F(xiàn)有的識別腸毒素sec的重組抗體不僅能識別sec，還能識別腸毒素seb，特異性較差，且sec的最低檢測限為8ng/ml，靈敏性較低。因此，亟需開發(fā)一種特異性好、靈敏度高的抗金黃色葡萄球菌腸毒素sec重組抗體。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中缺乏特異性好、靈敏度高的腸毒素sec重組抗體。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合腸毒素sec的抗原結(jié)合蛋白對，分別命名為9b7和16e12。利用9b7和16e12具有獨特的可變區(qū)序列，以16e12作為捕獲抗體，9b7作為檢測抗體，采用雙抗夾心檢測法對腸毒素sec進行檢測，其最低檢測限為0.1ng/ml，且對腸毒素sea、seb、sed、see和常見的微生物毒素均無交叉反應(yīng)。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白對特異性好，靈敏度高，具有準(zhǔn)確性和批間一致性。

3、本發(fā)明的第一個目的是提供了一種特異性結(jié)合腸毒素sec的抗原結(jié)合蛋白對，所述抗原結(jié)合蛋白對包括與腸毒素sec結(jié)合的第一抗原結(jié)合蛋白16e12和與結(jié)合有第一抗原結(jié)合蛋白16e12的腸毒素sec結(jié)合的第二抗原結(jié)合蛋白9b7，其中：

4、所述第一抗原結(jié)合蛋白16e12的重鏈可變區(qū)包含重鏈互補決定區(qū)vh-cdr4、vh-cdr5、vh-cdr6，氨基酸序列為seq?id?no.15-17所示或為與其同源性不低于90％的序列；

5、所述第一抗原結(jié)合蛋白16e12的輕鏈可變區(qū)包含輕鏈互補決定區(qū)vl-cdr4、vl-cdr5、vl-cdr6，氨基酸序列為seq?id?no.18-20所示或為與其同源性不低于90％的序列；

6、所述第二抗原結(jié)合蛋白9b7的重鏈可變區(qū)包含重鏈互補決定區(qū)vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3，氨基酸序列為seq?id?no.1-3所示或為與其同源性不低于90％的序列；

7、所述第二抗原結(jié)合蛋白9b7的輕鏈可變區(qū)包含輕鏈互補決定區(qū)vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3，氨基酸序列為seq?id?no.4-6所示或為與其同源性不低于90％的序列。

8、進一步地，所述抗原結(jié)合蛋白可為抗體或其抗原結(jié)合片段。

9、進一步地，所述第一抗原結(jié)合蛋白16e12的重鏈可變區(qū)包含框架區(qū)vh-fr5、vh-fr6、vh-fr7、vh-fr8；所述框架區(qū)vh-fr5、vh-fr6、vh-fr7、vh-fr8分別包含氨基酸序列為seq?id?no.21-24所示或與其同源性不低于90％的序列；

10、所述第二抗原結(jié)合蛋白9b7的重鏈可變區(qū)包含框架區(qū)vh-fr1、vh-fr2、vh-fr3、vh-fr4；所述框架區(qū)vh-fr1、vh-fr2、vh-fr3、vh-fr4分別包含氨基酸序列為seq?id?no.7-10所示或為與其同源性不低于90％的序列。

11、進一步地，所述第二抗原結(jié)合蛋白9b7相鄰兩個框架區(qū)之間設(shè)置互補決定區(qū)，因此第二抗原結(jié)合蛋白9b7的重鏈可變區(qū)上依次設(shè)置有vh-fr1、vh-cdr1、vh-fr2、vh-cdr2、vh-fr3、vh-cdr3、vh-fr4，輕鏈可變區(qū)上依次設(shè)置有vl-fr1、vl-cdr1、vl-fr2、vl-cdr2、vl-fr3、vl-cdr3、vl-fr4。

12、進一步地，所述第一抗原結(jié)合蛋白16e12相鄰兩個框架區(qū)之間設(shè)置互補決定區(qū)，因此第一抗原結(jié)合蛋白16e12的重鏈可變區(qū)上依次設(shè)置有vh-fr5、vh-cdr4、vh-fr6、vh-cdr5、vh-fr7、vh-cdr6、vh-fr8，輕鏈可變區(qū)上依次設(shè)置有vl-fr5、vl-cdr4、vl-fr6、vl-cdr5、vl-fr7、vl-cdr6、vl-fr8。

13、進一步地，所述第二抗原結(jié)合蛋白9b7還包含氨基酸序列如seq?id?no.29所示的重鏈恒定區(qū)和氨基酸序列如seq?id?no.31所示的輕鏈恒定區(qū)。

14、進一步地，所述第一抗原結(jié)合蛋白16e12還包括氨基酸序列如seq?id?no.30所示的重鏈恒定區(qū)和氨基酸序列如seq?id?no.31所示的輕鏈恒定區(qū)。

15、進一步地，所述恒定區(qū)的種屬來源為牛、馬、乳牛、豬、綿羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、貓、兔、驢、鹿、貂、雞、鴨、鵝或人。

16、進一步地，所述恒定區(qū)選自鼠源igg1、igg2a、igg2b、igg3或人源igg1、igg2、igg3、igg4、igm中的一種。

17、本發(fā)明的第二個目的是提供編碼上述抗原結(jié)合蛋白對的核酸分子。

18、本發(fā)明的第三個目的是提供含有上述核酸分子的表達載體。

19、進一步地，所述的表達載體可為病毒載體或非病毒載體，如dna、rna、病毒載體(如慢病毒、腺病毒、aav病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其組合)、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、其他基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、脂質(zhì)體納米顆粒等。

20、進一步地，所述宿主細胞可為原核細胞或真核細胞，如植物細胞、動物細胞、微生物等。優(yōu)選地，宿主細胞為中國倉鼠卵巢(cho)細胞、人胚胎腎細胞(hek293)、hela細胞、幼倉鼠腎細胞、ns0小鼠骨髓瘤細胞或其它哺乳動物細胞的一種。

21、本發(fā)明的第五個目的是提供含有上述抗原結(jié)合蛋白對的單價抗體、二價抗體或多價抗體。

22、本發(fā)明的第六個目的是提供還有上述抗原結(jié)合蛋白對的重組蛋白或免疫偶聯(lián)物。

23、進一步地，所述重組蛋白含有抗原結(jié)合蛋白對，以及協(xié)助表達和/或純化的標(biāo)簽序列。

24、進一步地，所述免疫偶聯(lián)物含有抗原結(jié)合蛋白對，以及偶聯(lián)部分，如可檢測標(biāo)記物。

25、本發(fā)明的第七個目的是提供一種用于腸毒素sec的檢測試劑盒，包含所述抗原結(jié)合蛋白對、核酸分子、表達載體、宿主細胞、單價抗體、二價抗體、多價抗體、重組蛋白或免疫偶聯(lián)物。

26、進一步地，所述的檢測包括流式檢測、細胞免疫熒光檢測、酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)檢測等。

27、本發(fā)明的第八個目的是提供了一種上述所述抗原結(jié)合蛋白對、上述重組蛋白或免疫偶聯(lián)物、上述核酸分子、上述表達載體或上述宿主細胞或上述試劑盒在制備腸毒素sec檢測產(chǎn)品中的應(yīng)用。

28、本發(fā)明的有益效果：

29、本發(fā)明通過不斷篩選成功獲得了一種能特異性識別腸毒素sec的抗原結(jié)合蛋白對，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白對具有獨特的可變區(qū)序列，對金黃色葡萄球菌腸毒素sec抗原具有良好的特異性和靈敏性；本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白對序列明確，能夠有效避免基因突變，抗原結(jié)合蛋白對的批間差異小、質(zhì)量穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)完整，有助于開發(fā)穩(wěn)定的免疫分析檢測方法。