本發(fā)明屬于合成生物學(xué)和工業(yè)生物，涉及一種構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物的大腸桿菌生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物的方法，具體涉及一種構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物a的大腸桿菌生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物a的方法，以及利用雙啟動(dòng)子載體構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物b大腸桿菌生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物b的方法。

背景技術(shù)：

1、結(jié)構(gòu)復(fù)雜而多樣的天然產(chǎn)物是創(chuàng)新藥物的重要來(lái)源，在新藥發(fā)現(xiàn)中起到重要作用。

2、近年來(lái)，c-糖苷類(lèi)化合物已成為許多天然生物堿和藥物活性藥物分子的重要組成部分，化合物a和化合物b均屬于c-糖苷類(lèi)化合物，是抗真菌化合物的重要前體，化合物a和化合物b的結(jié)構(gòu)分別如式i、ii所示：

3、

4、兩者含有d-葡萄糖與間苯二酚連接形成的c-糖基鍵，且化合物b含有通過(guò)c-o鍵和c-c鍵與芳香環(huán)連接形成獨(dú)特的螺環(huán)結(jié)構(gòu)，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)吸引了許多科研工作者進(jìn)行化學(xué)合成的探索。

5、c-糖苷類(lèi)化合物的化學(xué)合成方法主要有：通過(guò)雜-diels-alder反應(yīng)和5-芳基-2-乙烯基呋喃的二羥基化合成外消旋-螺旋酮單元，然后進(jìn)行achmatowicz重排；通過(guò)功能化有機(jī)鋰試劑與d-葡萄糖酸內(nèi)酯的環(huán)或無(wú)環(huán)衍生物的縮合。這些方法提供了制備化合物b中螺環(huán)結(jié)構(gòu)的途徑，但產(chǎn)率較低。也有利用鋰化己基吡喃糖對(duì)功能化醌的親核加成來(lái)獲得芳基-吡喃糖苷，然后通過(guò)鈀催化受保護(hù)的(三丁基)-己炔糖與芳基溴的交叉偶聯(lián)反應(yīng)制備化合物b，但是該方法由于供體的二聚化，需要過(guò)量的有毒錫試劑。

6、目前，尚未有上述兩種c-糖苷類(lèi)化合物的生物合成方法的報(bào)道。相比于化學(xué)合成方法，生物合成方法具有選擇性強(qiáng)、催化效率高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、催化劑制造成本低、反應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多天然產(chǎn)物可通過(guò)生物細(xì)胞工廠(chǎng)實(shí)現(xiàn)人工制備，從而提供全新而互補(bǔ)的合成策略。

7、大腸桿菌因研究歷史悠久、遺傳背景清晰、厭氧生長(zhǎng)速度快、能利用簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基并可利用多種底物(葡萄糖、木糖、甘油)等特點(diǎn)，成為了一種優(yōu)秀的工業(yè)模式微生物。代謝工程改造大腸桿菌，可用于生產(chǎn)有機(jī)醇、氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)胺、維生素、天然產(chǎn)物及聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，pha)等多種產(chǎn)品，并應(yīng)用于l-丙氨酸、l-賴(lài)氨酸、l-蘇氨酸、1,3-丙二醇、d-乳酸、丁二酸、戊二胺等大宗化學(xué)品的綠色生物合成。

8、構(gòu)建大腸桿菌細(xì)胞工廠(chǎng)的技術(shù)主要在于途徑設(shè)計(jì)、合成途徑創(chuàng)建與優(yōu)化和細(xì)胞全局優(yōu)化三個(gè)方面。在途徑設(shè)計(jì)方面，主要是優(yōu)化大腸桿菌自身代謝途徑、引入外源代謝途徑以及創(chuàng)建自然界中不存在的全新途徑。在合成途徑創(chuàng)建方面，需要用到dna片段組裝技術(shù)、基因組編輯技術(shù)和基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)，其中單基因調(diào)控、多基因調(diào)控和基因動(dòng)態(tài)調(diào)控這些基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)，對(duì)提高代謝途徑效率至關(guān)重要，也是構(gòu)建高效大腸桿菌細(xì)胞工廠(chǎng)的重要技術(shù)壁壘。在細(xì)胞全局優(yōu)化方面，最重要的因素是要考慮如何實(shí)現(xiàn)輔因子平衡，為此經(jīng)常需要根據(jù)途徑中所使用酶的特性，或改變輔因子的偏好性，或改變輔因子的再生途徑，在此基礎(chǔ)上通過(guò)自適應(yīng)進(jìn)化，不斷提高目標(biāo)產(chǎn)品的生產(chǎn)效率。若能通過(guò)以上策略構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物a和b的大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜天然產(chǎn)物的高效異源生物合成，對(duì)于促進(jìn)相關(guān)化合物的工業(yè)化生產(chǎn)以及臨床應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的是提供一種構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物a的大腸桿菌的方法，以及基于生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物a的大腸桿菌生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物a的方法；以及利用雙啟動(dòng)子載體構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物b的大腸桿菌的方法，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加生物合成前體3,5-二羥基苯甲醇或化合物a，從而實(shí)現(xiàn)化合物b的異源生物合成。

2、本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、一種生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物的方法，包括以下步驟：

4、步驟(b1)、將核苷酸序列如seq?id?no.1所示的基因g和核苷酸序列如seq?idno.2所示的基因k構(gòu)建入具有雙t7啟動(dòng)子的pcdfduet-1質(zhì)粒載體，得到重組質(zhì)粒pcdfduet-1-gk1，將重組質(zhì)粒pcdfduet-1-gk1轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(e.coli)bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌；

5、步驟(b2)、將步驟(b1)所述的重組大腸桿菌接種在含有壯觀霉素的培養(yǎng)基中，加入異丙基硫代半乳糖苷(異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，iptg)誘導(dǎo)重組大腸桿菌蛋白表達(dá)，得到生產(chǎn)結(jié)構(gòu)如式ii所示的化合物b的菌株，再向培養(yǎng)基中加入3,5-二羥基苯甲醇或結(jié)構(gòu)如式i所示的化合物a作為底物，培養(yǎng)得到化合物b；

6、

7、步驟(b2)中，重組大腸桿菌在含有50μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至od600為0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組大腸桿菌蛋白表達(dá)，再向培養(yǎng)基中加入3,5-二羥基苯甲醇或化合物a作為底物培養(yǎng)，收集菌體，提取分離，得到化合物b。

8、優(yōu)選的，在溫度37℃下，重組大腸桿菌在含有50μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至od600為0.8，

9、優(yōu)選的，所述的誘導(dǎo)重組大腸桿菌蛋白表達(dá)的溫度為16～20℃，時(shí)間為4～8h。

10、優(yōu)選的，所述的異丙基硫代半乳糖苷的終濃度為100μm。

11、優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)基為lb液體培養(yǎng)基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，自然ph。

12、優(yōu)選的，每1l培養(yǎng)基中加入3,5-二羥基苯甲醇0.01～0.1g。

13、所述的化合物b的提取分離方法為：培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)物離心，收集菌體，將菌體重懸于甲醇中，超聲萃取2～4次，合并提取液，提取液減壓濃縮除去甲醇，得到粗浸膏，粗浸膏上mci色譜柱，選擇甲醇-水體系進(jìn)行梯度洗脫，得到5個(gè)流分frb.1-frb.5；取流分frb.1，進(jìn)行sephadex?lh-20凝膠柱層析，以純水為流動(dòng)相等度洗脫，得4個(gè)亞流分frb.9.1-frb.9.4；取亞流分fr.9.4，進(jìn)行半制備rp-hplc(反相高效液相色譜)，得到化合物b。

14、所述的離心的溫度為4℃，離心的轉(zhuǎn)速為5000rpm，離心的時(shí)間為20分鐘。

15、每次超聲提取時(shí)，所述的菌體和甲醇的體積比為1:1～1:1.5。所述的超聲萃取的超聲功率為500w；每次超聲萃取20～30分鐘。

16、所述的mci色譜柱的填料為hp20；所述的甲醇-水體系為水、30％甲醇、60％甲醇、90％甲醇、100％甲醇。

17、所述的半制備rp-hplc的條件：capcell?pak?mgⅱc18色譜柱(5μm；4.6×250mm)，流動(dòng)相：1.5％meoh-h2o，等度洗脫，流速3ml·min-1。

18、一種生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物的方法，包括以下步驟：

19、步驟(a1)、將核苷酸序列如seq?id?no.1所示的基因g構(gòu)建入pet-28a(+)質(zhì)粒載體，得到重組質(zhì)粒pet-28a(+)-1，將重組質(zhì)粒pet-28a(+)-1轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(e.coli)bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌；

20、步驟(a2)、將步驟(a1)所述的重組大腸桿菌接種在含有硫酸卡那霉素的培養(yǎng)基中，加入異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組大腸桿菌蛋白表達(dá)，得到生產(chǎn)結(jié)構(gòu)如式i所示的化合物a的菌株，再向培養(yǎng)基中加入3,5-二羥基苯甲醇作為底物，培養(yǎng)得到化合物a；

21、

22、步驟(a2)中，重組大腸桿菌在含有50μg/ml硫酸卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至od600為0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組大腸桿菌蛋白表達(dá)，再向培養(yǎng)基中加入3,5-二羥基苯甲醇培養(yǎng)，收集菌體，菌體經(jīng)提取分離，得到化合物a。

23、所述的誘導(dǎo)重組大腸桿菌蛋白表達(dá)的溫度為16～20℃，時(shí)間為4～8h。

24、所述的培養(yǎng)基中，異丙基硫代半乳糖苷的終濃度為100μm。

25、所述的培養(yǎng)基為lb液體培養(yǎng)基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，自然ph。

26、每1l培養(yǎng)基中加入3,5-二羥基苯甲醇0.01～0.1g。

27、所述的化合物a的提取分離方法為：培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)物離心，收集菌體，將菌體重懸于甲醇中，超聲萃取2～4次，合并提取液，提取液減壓濃縮除去甲醇，得到粗浸膏，粗浸膏上mci色譜柱，選擇甲醇-水體系進(jìn)行梯度洗脫，得到5個(gè)流分fra.1-fra.5；取流分fra.1，進(jìn)行sephadex?lh-20凝膠柱層析，以純水為流動(dòng)相等度洗脫，得4個(gè)亞流分fra.9.1-fra.9.4；取亞流分fr.9.2，進(jìn)行半制備rp-hplc，得到化合物a。

28、所述的離心的溫度為4℃，離心的轉(zhuǎn)速為5000rpm，離心的時(shí)間為20分鐘。

29、每次超聲提取時(shí)，所述的菌體和甲醇的體積比為1:1～1:1.5。

30、所述的超聲萃取的超聲功率為500w；每次超聲萃取20～30分鐘。

31、所述的mci色譜柱的填料為hp20；所述的甲醇-水體系為水、30％甲醇、60％甲醇、90％甲醇、100％甲醇。

32、所述的半制備rp-hplc的條件：capcell?pak?mgⅱc18色譜柱(5μm；4.6×250mm)，流動(dòng)相：1.0％meoh-h2o，等度洗脫，流速3ml·min-1。

33、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種基因g，基因g的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

34、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種基因k，基因k的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

35、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生物材料，所述的生物材料為包含所述的基因g和/或基因k的生物材料，所述生物材料為表達(dá)盒、質(zhì)粒載體、工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

36、優(yōu)選的，所述的生物材料為包含所述的基因g的生物材料、包含基因g和基因k的生物材料。

37、所述的生物材料為(1)～(14)中的至少一種：

38、(1)含有所述的基因g的表達(dá)盒；

39、(2)含有所述的基因g的重組質(zhì)粒載體；

40、(3)含有(1)所述的表達(dá)盒的重組質(zhì)粒載體；

41、(4)含有所述的基因g的工程菌；

42、(5)含有(1)所述的表達(dá)盒的工程菌；

43、(6)含有(2)所述重組質(zhì)粒載體的工程菌；

44、(7)含有(3)所述的重組質(zhì)粒載體的工程菌；

45、(8)含有所述的基因g和基因k的表達(dá)盒；

46、(9)含有所述的基因g和基因k的重組質(zhì)粒載體；

47、(10)含有(8)所述的表達(dá)盒的重組質(zhì)粒載體；

48、(11)含有所述的基因g和基因k的工程菌；

49、(12)含有(8)所述的表達(dá)盒的工程菌；

50、(13)含有(9)所述重組質(zhì)粒載體的工程菌；

51、(14)含有(10)所述的重組質(zhì)粒載體的工程菌。

52、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的基因g在制備c-糖苷類(lèi)化合物a的應(yīng)用或在構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物a的重組質(zhì)粒載體、在構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物a的重組大腸桿菌中的應(yīng)用。

53、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物a的重組質(zhì)粒載體的方法，包括：選擇pet-28a(+)質(zhì)粒載體，將基因g構(gòu)建入pet-28a(+)質(zhì)粒載體，得到重組質(zhì)粒pet-28a(+)-1。

54、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物a的重組大腸桿菌的方法，包括：選擇pet-28a(+)質(zhì)粒載體，將基因g構(gòu)建入pet-28a(+)質(zhì)粒載體得到重組質(zhì)粒pet-28a(+)-1，將重組質(zhì)粒pet-28a(+)-1轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(e.coli)bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌。

55、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的基因g和基因k在制備c-糖苷類(lèi)化合物b的應(yīng)用、或在構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物b的重組質(zhì)粒載體、在構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物b的重組大腸桿菌中的應(yīng)用。

56、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物b的重組質(zhì)粒載體的方法，包括：選擇具有雙t7啟動(dòng)子的pcdfduet-1質(zhì)粒載體，將基因g和基因k構(gòu)建入pcdfduet-1質(zhì)粒載體，得到重組質(zhì)粒pcdfduet-1-gk1。

57、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建生產(chǎn)c-糖苷類(lèi)化合物b的重組大腸桿菌的方法，包括：選擇具有雙t7啟動(dòng)子的pcdfduet-1質(zhì)粒載體，將基因g和基因k構(gòu)建入pcdfduet-1質(zhì)粒載體，得到重組質(zhì)粒pcdfduet-1-gk1，將重組質(zhì)粒pcdfduet-1-gk1轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(e.coli)bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌。

58、本發(fā)明的有益效果：

59、本發(fā)明利用pet-28a(+)載體與基因g構(gòu)建重組質(zhì)粒，進(jìn)一步構(gòu)建了化合物a生產(chǎn)菌株。

60、本發(fā)明選擇具有雙t7啟動(dòng)子的pcdfduet-1質(zhì)粒載體，基因g與定向進(jìn)化后的基因k構(gòu)建成共表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化至e.coli?bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中獲得重組大腸桿菌，并且通過(guò)異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組大腸桿菌蛋白表達(dá)，向lb培養(yǎng)基中加入生物合成前體3,5-二羥基苯甲醇或化合物a，最終實(shí)現(xiàn)化合物b的異源生物合成。

61、本發(fā)明首次提供了異源生物合成c-糖苷類(lèi)化合物a和b的方法，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。