本發(fā)明屬于生物，涉及一種截短豬肺炎支原體p65重組蛋白及其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬支原體肺炎(mycoplasmapneumoniaofswine，mps)，俗稱豬氣喘病、豬地方流行性肺炎，其病原是豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae，mhp)。mhp病原體是一種較小(0.2μm～0.4μm)、無(wú)固定形態(tài)(無(wú)細(xì)胞壁)的原核生物，其是一種以氣喘和咳嗽為主要癥狀的豬呼吸系統(tǒng)慢性傳染病，易感動(dòng)物感染率高，哺乳仔豬、保育豬、育肥豬、公豬以及母豬均能夠感染。mhp通過(guò)破壞上皮表面的纖毛影響?zhàn)つで宄到y(tǒng)，此外，還會(huì)影響呼吸道的免疫系統(tǒng)。而mhp一旦感染，其菌株在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)持續(xù)存在至少12周，這意味著感染后的動(dòng)物免疫反應(yīng)不能迅速將其從呼吸道中清除。因此mhp使動(dòng)物容易同時(shí)感染其他病原體，包括細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和病毒。

2、據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球豬群mps感染陽(yáng)性率約為70％～80％，發(fā)病率為40％以上。mps的剖檢病變特征為肺臟尖葉和心葉呈“肉樣”或“蝦肉樣”實(shí)變，也稱之為“胰腺樣變”，同時(shí)患病豬也會(huì)出現(xiàn)諸如生長(zhǎng)發(fā)育不良，料肉比高等不良結(jié)果，從而極大的增加了養(yǎng)殖成本并降低了豬肉的品質(zhì)。因此，研究如何對(duì)該病進(jìn)行有效防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

3、目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了大量關(guān)于mhp疫苗、檢測(cè)和診斷方法的研究。疫苗方面，目前廣泛使用的商品化mps疫苗主要是減毒活疫苗和滅活疫苗。商品化疫苗一般為一針劑或兩針劑，并且可以和豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)、副豬嗜血桿菌混合/聯(lián)合免疫。但一些研究表明，傳統(tǒng)的商品化疫苗對(duì)典型的mhp引起的臨床癥狀和損害的保護(hù)往往不完整，疫苗接種不能防止病原體定植，并且不能顯示出十分顯著的免疫效果在mps基因工程疫苗研制的早期，為了達(dá)到成分簡(jiǎn)單和有效保護(hù)的目的，主要集中在單一抗原的表達(dá)研究。隨著研究進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)由單一抗原組成的疫苗不足以誘導(dǎo)足夠的免疫保護(hù)。因此，需要研發(fā)由多種抗原組成的嵌合疫苗，以產(chǎn)生相對(duì)理想的免疫效果。檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，elisa檢測(cè)是最常見(jiàn)的使用血清學(xué)檢測(cè)方法。然而，mph表現(xiàn)出相對(duì)豬鼻炎支原體等的密切關(guān)系通常會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致以全細(xì)胞蛋白為包被抗原的elisa檢測(cè)的特異性較低。因此基于對(duì)特定蛋白的研究建立特定的診斷方法已成為解決這一問(wèn)題的解決方案之一。

4、目前已知mhp主要免疫蛋白，包括p36、p46、p65、p74和p97。特別是p65，這是一種攜帶屬特異性表位的膜蛋白，是mhp的主要免疫原性蛋白，可在斷奶豬和生長(zhǎng)豬中引發(fā)早期免疫反應(yīng)，且與其他支原體無(wú)交叉反應(yīng)。此外，它的抗血清還可以抑制支原體的體外生長(zhǎng)。因此，p65蛋白可以用作建立mhp的診斷方法和一種候選亞基蛋白疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供一種通過(guò)大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)制備豬肺炎支原體p65重組蛋白的方法，并使蛋白具有良好的生物活性和免疫原性。

2、基于上述目的，本發(fā)明提供一種豬肺炎支原體p65重組蛋白及其截短蛋白，豬肺炎支原體p65重組蛋白的序列為序列表中序列2；豬肺炎支原體p65重組蛋白的截短蛋白為序列表中序列4。

3、本發(fā)明還提供所述的豬肺炎支原體p65重組蛋白的編碼基因；優(yōu)選的，所述豬肺炎支原體p65重組蛋白的編碼基因如序列表中序列1所示、所述豬肺炎支原體p65重組蛋白的截短蛋白的編碼基因如序列表中序列3所示。

4、本發(fā)明還提供表達(dá)所述豬肺炎支原體p65重組蛋白或其截短蛋白的重組載體，是將序列1所示豬肺炎支原體p65重組蛋白的編碼基因插入到出發(fā)載體中獲得的。

5、所述出發(fā)載體優(yōu)選為pet-22b載體。

6、優(yōu)選的，所述序列1或序列3所示的豬肺炎支原體全長(zhǎng)及截短p65蛋白的編碼基因插入到pet-22b的ndeⅰ和bamhⅰ酶識(shí)別位點(diǎn)之間。

7、本發(fā)明還提供一種表達(dá)所述豬肺炎支原體p65重組蛋白或其截短蛋白的工程菌，是將所述的表達(dá)所述豬肺炎支原體p65重組蛋白或其截短蛋白的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)，篩選得到的表達(dá)豬肺炎支原體p65重組蛋白及其截短蛋白的重組菌。

8、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種豬肺炎支原體p65重組蛋白的制備方法，是將所述的工程菌進(jìn)行培養(yǎng)，利用iptg誘導(dǎo)表達(dá)蛋白；收集截短豬肺炎支原體p65重組蛋白重組菌破碎后的上清及包涵體，收集全長(zhǎng)豬肺炎支原體p65重組蛋白重組菌破碎后的包涵體；純化得到全長(zhǎng)豬肺炎支原體p65重組蛋白或截短豬肺炎支原體p65重組蛋白。

9、優(yōu)選的，所述方法包括下述步驟：

10、1)將所述的表達(dá)所述豬肺炎支原體p65重組蛋白或其截短蛋白的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)，得到表達(dá)豬肺炎支原體p65重組蛋白或其截短蛋白的重組菌；

11、2)將步驟1)獲得的重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體并破碎，收集上清及包涵體；

12、3)將步驟2)獲得的包涵體溶解復(fù)性獲得豬肺炎支原體p65或其截短蛋白包涵體重組蛋白；

13、4)將截短豬肺炎支原體p65重組上清及包涵體蛋白濃縮純化，將全長(zhǎng)豬肺炎支原體p65重組包涵體蛋白濃縮純化。

14、具體的，所述方法包括下述步驟：

15、(1)目的基因合成：序列1、序列3所示的豬肺炎支原體全長(zhǎng)及截短p65蛋白基因序列插入到pet-22b的ndeⅰ和bamhⅰ酶識(shí)別位點(diǎn)之間，得到表達(dá)表達(dá)所述豬肺炎支原體p65重組蛋白或其截短蛋白的的重組載體，將其命名為pet-p65；

16、(2)重組菌株篩選：將步驟(1)獲得的質(zhì)粒pet-p65轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)bl21(de3)；獲得表達(dá)所述豬肺炎支原體p65重組蛋白或其截短蛋白的的工程菌株，將兩者分別命名為e.coli-mhp-p65-qc和e.coli-mhp-p65-jd；

17、(3)重組蛋白的表達(dá)：將步驟(2)獲得的菌株e.coli-mhp-p65-qc和e.coli-mhp-p65-jd進(jìn)行培養(yǎng)，利用適當(dāng)濃度的iptg誘導(dǎo)表達(dá)蛋白；

18、(4)重組蛋白的獲?。弘x心收集步驟(3)獲得的重組菌，超聲破碎菌體，離心得到含有豬肺炎支原體截短p65重組蛋白的上清，刮去沉淀上層的菌泥，收集包涵體，得到含有豬肺炎支原體全長(zhǎng)及截短p65重組蛋白的包涵體；

19、(5)重組蛋白的純化：將步驟(4)含有豬肺炎支原體截短p65重組蛋白的上清用0.45μm濾膜過(guò)濾，通過(guò)his親和層析柱進(jìn)行蛋白純化；

20、(6)重組包涵體蛋白的變性、復(fù)性及純化：將步驟(4)含有豬肺炎支原體全長(zhǎng)及截短p65重組蛋白的包涵體分別用包涵體溶解液溶解包涵體，將溶解后的包涵體緩慢加入包涵體復(fù)性液進(jìn)行稀釋復(fù)性，4℃攪拌48h,將置換液緩慢加入復(fù)性液中，4℃濃縮，最后得到濃縮的豬肺炎支原體p65重組包涵體蛋白。

21、本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述豬肺炎支原體全長(zhǎng)及截短p65重組蛋白或所述豬肺炎支原體p65全長(zhǎng)及截短重組蛋白的編碼基因所制備豬肺炎支原體p65重組蛋白的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括但不限于在制備豬肺炎支原體的診斷試劑、預(yù)防或治療豬肺炎支原體疫苗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

22、本發(fā)明的積極有益效果：

23、本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)全長(zhǎng)及截短豬肺炎支原體p65重組蛋白。其中截短表達(dá)所獲得的蛋白表達(dá)量大，穩(wěn)定性極好，且純化方法簡(jiǎn)單，極大降低了生產(chǎn)成本，有利于推進(jìn)之后的大批量生產(chǎn)和應(yīng)用；

24、本發(fā)明優(yōu)化了豬肺炎支原體p65重組蛋白的編碼序列，提高了蛋白表達(dá)量，截短表達(dá)的p65蛋白上清液和包涵體中均可大量表達(dá)。通過(guò)特定配方的蛋白復(fù)性液、置換液處理包涵體，使最終得到的豬肺炎支原體p65重組蛋白具有較好的生物活性、蛋白穩(wěn)定性較好；

25、經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，用本發(fā)明制備的截短p65重組蛋白免疫小鼠和豬，均可產(chǎn)生高水平抗體，為疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。

26、經(jīng)elisa結(jié)果驗(yàn)證，用本發(fā)明制備的截短p65重組蛋白建立的檢測(cè)豬肺炎支原體抗體水平檢測(cè)方法與商品化試劑盒有很好的符合率。為豬肺炎支原體的檢測(cè)的建立奠定了基礎(chǔ)。