本發(fā)明涉及生物，更具體地說，涉及一種噬菌體制劑的純化方法及其在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性被認(rèn)為是21世紀(jì)人類面臨的最大難題之一，對(duì)全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)的重大威脅。噬菌體作為細(xì)菌在自然界中的天敵物種，具有分布廣泛、殺菌高效、自我復(fù)制和宿主專一等諸多優(yōu)點(diǎn)，被公認(rèn)為是頗具潛力的抗生素替代品。人類關(guān)于噬菌體的研究由來已久，但是隨著抗生素和化學(xué)抗菌藥物的大量出現(xiàn)及在對(duì)抗細(xì)菌性感染方面表現(xiàn)出的高效性，使得噬菌體在歐美等發(fā)達(dá)國家的研究一度中斷，直至上世紀(jì)八十年代，由于多重耐藥菌的出現(xiàn)，人類又重新重視噬菌體的研究，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，噬菌體已廣泛應(yīng)用到人類疫病防控、動(dòng)植物細(xì)菌性病害及保障食品安全等方面，成為人類對(duì)抗細(xì)菌性感染的利器。

2、噬菌體制劑的純度，換言之雜質(zhì)殘留水平，與其安全性直接相關(guān)，是噬菌體制劑質(zhì)量控制的重要檢測(cè)指標(biāo)之一。對(duì)于革蘭氏陰性致病菌，噬菌體裂解宿主菌后會(huì)引起細(xì)胞外膜層脂多糖(即內(nèi)毒素)的大量釋放，典型的革蘭氏陰性菌噬菌體裂解液中內(nèi)毒素含量可達(dá)到105～106eu/ml。細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖(lps)，由核心多糖、類脂a和o-特異側(cè)鏈組成，其具有很高的熱穩(wěn)定性，100℃高溫下加熱1小時(shí)也不會(huì)被破壞，只有在160℃的溫度下加熱2到4個(gè)小時(shí)，或用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加溫煮沸30分鐘才能將其滅活，所以很難將其去除。內(nèi)毒素單位一般以eu(endotoxin?unit)或者iu(international?unit)計(jì)，1eu＝1iu，相當(dāng)于0.2ng脂多糖(fda標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。雖然內(nèi)毒素口服毒性很小，但腸黏膜功能受損后，存在入血風(fēng)險(xiǎn)，過量時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱、休克、多器官功能衰竭甚至死亡。對(duì)于噬菌體制劑中內(nèi)毒素限值，歐洲藥典中規(guī)定，靜脈注射和口服給藥的內(nèi)毒素限值分別為0.2iu或5iu體重，美國fda的要求是同歐洲藥典相同的。對(duì)于臨床應(yīng)用，靜脈和口服給藥制劑的內(nèi)毒素限度分別為5eu/h/kg和20eu/ml。因此，對(duì)于噬菌體制劑，必須采取有效策略從源頭——噬菌體裂解液中去除內(nèi)毒素并對(duì)其殘留量進(jìn)行檢測(cè)。

3、世界各地的學(xué)者已經(jīng)對(duì)噬菌體制劑中內(nèi)毒素的檢測(cè)與去除方案開展了廣泛的研究，主要方法包括tritonx-100解離與氯仿透析、氯化銫密度梯度離心以及l(fā)ps親和層析等方法，通過親脂溶劑降低脂多糖在噬菌體制劑中的含量，內(nèi)毒素去除效果顯著。但是這些方法普遍存在步驟多、過程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力、能耗大，污染環(huán)境等弊端。氯仿會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)產(chǎn)生抑制作用，可能會(huì)導(dǎo)致頭暈、頭痛、疲勞與意識(shí)模糊；氯化銫與tritionx-100會(huì)引起眼睛、呼吸道和皮膚的刺激。此外，雖然目前沒有明確的證據(jù)表明tritionx-100有致癌性，但其潛在的毒性和對(duì)人體的危害仍需要引起重視。也有學(xué)者嘗試使用聚乙二醇沉淀法，但這種方法處理量小且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。電荷吸附近年來也被用于純化噬菌體，其具備較高的噬菌體回收率但內(nèi)毒素去除率較低。

4、因此，亟需開發(fā)一種新的制備方法，既滿足控制噬菌體裂解液中內(nèi)毒素含量保持在較低的范圍，又不涉及有機(jī)試劑，滿足安全要求的純化噬菌體制劑的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前噬菌體制劑純化工藝復(fù)雜、內(nèi)毒素去除率低以及會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害和對(duì)環(huán)境的污染等問題，提供一種避免有機(jī)試劑參與的純化噬菌體制劑的方法。本發(fā)明提供的純化方法首先采用分級(jí)微濾膜去除噬菌體裂解液中存在的細(xì)菌以及細(xì)菌碎片等雜質(zhì)，然后采用切向流過濾柱去除包括游離的內(nèi)毒素在內(nèi)的雜質(zhì)，最后采用新型復(fù)合型層析介質(zhì)進(jìn)一步去除包括游離的內(nèi)毒素在內(nèi)的游離的雜質(zhì)。本發(fā)明提供的純化方法的所有操作均沒有涉及到有機(jī)試劑，主要利用內(nèi)毒素與噬菌體顆粒的分子量大小差異實(shí)現(xiàn)分離。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一方面，提供了一種噬菌體制劑的純化方法，包括如下步驟：

4、s1、取噬菌體裂解液，采用截留孔徑為0.45μm、0.22μm的分級(jí)微濾膜依次對(duì)所述噬菌體裂解液進(jìn)行微濾，得到料液；所述噬菌體裂解液內(nèi)含有內(nèi)毒素，所述內(nèi)毒素源自噬菌體裂解液中的細(xì)菌和/或細(xì)菌碎片；

5、s2、采用截留分子量為300～750kda的切向流過濾柱對(duì)所述料液進(jìn)行超濾，得到回流端濾液；所述切向流過濾柱的剪切速率為4000～8000s-1，所述切向流過濾柱管路的系統(tǒng)壓力設(shè)置為恒定值，所述恒定值的范圍為1～2psi；

6、s3、采用“分子排阻-電荷吸附”復(fù)合型層析柱對(duì)所述回流端濾液進(jìn)行純化，得到高純度的噬菌體制劑；所述“分子排阻-電荷吸附”復(fù)合型層析柱的層析介質(zhì)為captocore400tm，上樣緩沖液為pbs緩沖液。

7、優(yōu)選方案下，步驟s2所述切向流過濾柱的截留分子量為500kda，剪切速率為8000s-1，所述切向流過濾柱管路的系統(tǒng)壓力設(shè)置為1psi。

8、優(yōu)選方案下，所述噬菌體裂解液選自長尾噬菌體裂解液、短尾噬菌體裂解液和肌尾噬菌體裂解液中的一種或多種。

9、優(yōu)選方案下，步驟s1所述細(xì)菌和/或細(xì)菌碎片為革蘭氏陰性菌，所述革蘭氏陰性菌選自臨床、畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的致病性革蘭氏陰性菌。

10、優(yōu)選方案下，所述致病性革蘭氏陰性菌選自銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和沙門氏菌中的一種或多種。

11、優(yōu)選方案下，超濾前，依次使用0.1m?naoh、pbs緩沖液潤洗切向流過濾柱。

12、優(yōu)選方案下，所述切向流過濾柱為中空纖維柱。

13、最優(yōu)方案下，一種噬菌體制劑的純化方法，包括如下步驟：

14、s1、取噬菌體裂解液，采用微濾膜對(duì)噬菌體裂解液進(jìn)行微濾去除噬菌體裂解液中存在的細(xì)菌、細(xì)菌碎片等雜質(zhì)，得到料液；

15、s2、采用切向流過濾柱對(duì)料液進(jìn)行超濾，收集得到回流端濾液；

16、s3、采用“分子排阻-電荷吸附”復(fù)合型層析柱繼續(xù)純化回流端濾液，將回流端濾液泵入“分子排阻-電荷吸附”復(fù)合型層析柱后，觀察首個(gè)穿透峰并收集其對(duì)應(yīng)的濾液，在電腦上觀察到紫外吸收檢測(cè)值開始上揚(yáng)至回到基線時(shí)收集的濾液，即為純化后的噬菌體制劑。

17、上述最優(yōu)方案下噬菌體制劑的純化方法的實(shí)驗(yàn)條件如下：

18、步驟s1中，采用截留孔徑為0.45μm、0.22μm的微濾膜依次對(duì)噬菌體裂解液進(jìn)行過濾。

19、步驟s2中，切向流過濾柱的分子截留量為500kda，超濾過程中系統(tǒng)壓力應(yīng)保持恒定為1系統(tǒng)壓力，剪切速率為8000s-1。截留分子量過低時(shí)，能夠去除的內(nèi)毒素含量有限；當(dāng)截留分子量過高時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致純化過程中損失大量噬菌體顆粒。當(dāng)系統(tǒng)壓力過低時(shí)透過端則不會(huì)流出液體，不能實(shí)現(xiàn)噬菌體顆粒與雜質(zhì)的分離，當(dāng)系統(tǒng)壓力過高時(shí)則會(huì)引起噬菌體顆粒大量損失。上樣流速過低則會(huì)使整個(gè)分離的時(shí)間過長且影響分離效果。

20、步驟s3中，“分子排阻-電荷吸附”復(fù)合型層析柱的填料為captocore?400tm填料，該填料內(nèi)含有大量微球，直徑小于20nm的物質(zhì)會(huì)通過微球表面的小孔進(jìn)入微球，微球內(nèi)部是功能化的配體，即疏水又帶正電，可以使進(jìn)入微球的雜質(zhì)被吸附在微球核心內(nèi)，直徑大于20nm的物質(zhì)則會(huì)流出層析柱，從而實(shí)現(xiàn)噬菌體液內(nèi)噬菌體與內(nèi)毒素等雜質(zhì)的分離。

21、步驟s3中，所選用的上樣緩沖液為pbs緩沖液，此緩沖液不含鈣、鎂離子，后續(xù)洗脫層析柱雜質(zhì)時(shí)不會(huì)引起產(chǎn)生絮狀物進(jìn)而造成層析柱堵塞。

22、本發(fā)明的第二方面，提供了一種上述任一純化方法在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用，如下任一項(xiàng)至多項(xiàng)：

23、(1)用于制備噬菌體制劑；

24、(2)用于制備以噬菌體制劑為有效成份的抗菌產(chǎn)品。

25、本發(fā)明的有益效果

26、1、內(nèi)毒素去除效果顯著，噬菌體制劑內(nèi)毒素含量低于20eu/109pfu(去除率＞99％)，低于臨床應(yīng)用口服給藥制劑的內(nèi)毒素限度。

27、2、本發(fā)明適用性廣，對(duì)短尾科、肌尾科和長尾科不同類型噬菌體的裂解液均有良好的內(nèi)毒素去除效果。

28、3、本發(fā)明的所有步驟均不涉及有機(jī)試劑，相較于其它內(nèi)毒素去除方案，安全性更高，更環(huán)保。

29、4、本發(fā)明提供的噬菌體制劑的純化方法處理量大，工藝簡單，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

30、5、本發(fā)明的純化方案純化的噬菌體裂解液內(nèi)毒素去除率為99.20％，噬菌體留存率為64.84％；經(jīng)過傳統(tǒng)解離方案純化的噬菌體裂解液內(nèi)毒素去除率為98.40％，噬菌體留存率為25.02％。本發(fā)明純化方案與傳統(tǒng)解離方案相比不僅顯著提高了內(nèi)毒素去除率與噬菌體回收率，避免了有機(jī)試劑的參與，各方面顯著優(yōu)于傳統(tǒng)解離方案，更適合應(yīng)用于噬菌體的工業(yè)規(guī)模應(yīng)用。