本發(fā)明屬于害蟲防治領域，涉及核酸殺蟲劑，尤其是一種雙鏈rna?（double-stranded,?dsrna）納米核酸殺蟲劑。

背景技術：

1、到目前為止，化學農(nóng)藥仍然是控制農(nóng)業(yè)害蟲的主要手段，然而，化學農(nóng)藥缺乏選擇性，在殺死害蟲的同時也可能誤傷天敵、蜜蜂或其它生物，另外，隨著化學農(nóng)藥的頻繁使用，害蟲的抗藥性問題頻發(fā)，防治效果不斷下降。為了有效應對化學農(nóng)藥產(chǎn)生的選擇性、抗藥性等問題，近些年來，新型核酸殺蟲劑正在不斷研發(fā)上市。與化學農(nóng)藥不同的是，核酸殺蟲劑在害蟲體內(nèi)引發(fā)“rna干擾”，導致基因沉默和害蟲死亡，是一種安全、綠色、高效的新型農(nóng)藥。

2、“rna干擾”是本世紀最重要的生物學發(fā)現(xiàn)之一，它最初是通過轉(zhuǎn)基因手段，使農(nóng)作物產(chǎn)生針對害蟲的雙鏈rna，誘食后再啟動rna干擾程序，殺死害蟲或抑制其生長繁殖。隨后又發(fā)現(xiàn)，通過作物表面噴灑，或注射、種子處理、土壤澆灌等方式施用，雙鏈rna也能被作物吸收擴散并進入害蟲體內(nèi)發(fā)揮作用。目前，這種非轉(zhuǎn)基因的核酸殺蟲劑已經(jīng)在小菜蛾、果實蠅、粉虱等害蟲的防治中取得積極進展。

3、刺吸式害蟲被認為是全球農(nóng)業(yè)中最重要的害蟲群體之一，具有種類多、分布廣、食性雜、繁殖力強、危害重等特點，其取食會造成枝葉及花卷曲、畸形、萎蔫，嚴重者甚至整株枯萎或死亡，并且其在取食的同時還能傳播病毒。與咀嚼式害蟲不同的是，刺吸式害蟲是以刺針方式進行吸食，因此需要在植物汁液中存在雙鏈rna，而植物表皮的蠟質(zhì)層、角質(zhì)層、細胞壁、細胞膜都對雙鏈rna的吸收擴散構成屏障。另外，rna分子的穩(wěn)定性差，容易被核酸酶降解，也能被紫外、高溫和酸堿性環(huán)境破壞。此外，不同作物對雙鏈rna傳遞方式不同，不同害蟲對雙鏈rna的吸收效率也各異，造成不同害蟲的rna干擾效果差異很大。以上這些都是決定核酸殺蟲劑對刺吸式害蟲防治成敗的關鍵因素。

4、納米顆粒是直徑在1至100?nm范圍內(nèi)的顆粒，具有高生物相容性和可降解性，而且毒性和成本較低，目前，納米材料已被廣泛應用于各個領域。在農(nóng)業(yè)領域，納米顆粒可以提高dsrna的遞送效率和穩(wěn)定性，從而促進dsrna生物農(nóng)藥的開發(fā)。基于此，本研究篩選了刺吸式害蟲靶基因，基于篩選的靶基因合成dsrna，并研究納米顆粒對dsrna的增效作用，最終開發(fā)了一種高效綠色的刺吸式害蟲防控策略。

技術實現(xiàn)思路

1、rna干擾（rnai）已被證實是一種強大的殺蟲技術，在刺吸式害蟲中，雙鏈rna（dsrna）可通過植物體壁吸收，再通過誘食途徑輸送到害蟲體內(nèi)。然而，dsrna作為核酸殺蟲劑在刺吸式害蟲中的使用效果受到植物表面和細胞壁施加的獨特屏障阻礙，這種屏障阻礙了dsrna向植物體內(nèi)的有效傳遞。為此，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術的不足，提出了一種針對刺吸式害蟲的dsrna納米核酸殺蟲劑，它以納米材料mgal-ldh和mgfe-ldh為載體，負載dsrna后高效靶向遞送dsrna，干擾靶標基因表達并促進刺吸式害蟲的死亡，達到綠色高效治理刺吸式害蟲的目的。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明使用了以下技術方案：

3、用于防治刺吸式害蟲的dsrna納米核酸殺蟲劑，它由特異性靶向刺吸式害蟲 chs基因的dsrna和載體組成，所述刺吸式害蟲為柑橘全爪螨 panonychus?citri、柑橘木虱 diaphorina?citri或棉蚜 aphis?gossypii，所述柑橘全爪螨 chs基因（簡稱 pcchs基因）的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述柑橘木虱 chs基因（簡稱 dcchs基因）的核苷酸序列如seqid?no.2所示，所述棉蚜 chs基因（簡稱 agchs基因）的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，所述載體是mgal或mgfe層狀雙金屬氫氧化物納米粒。

4、所述dsrna納米核酸殺蟲劑的制備方法包括以下步驟：

5、1）提取刺吸式害蟲總rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，以cdna為模板，設計引物擴增所述 chs基因，將擴增產(chǎn)物與載體質(zhì)粒連接，獲得 chs基因的表達質(zhì)粒；

6、2）在所設計的引物的5′端連接t7?啟動子序列，以構建的表達質(zhì)粒為模板進行pcr擴增，將擴增產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄合成特異性靶向刺吸式害蟲 chs基因的dsrna；

7、3）將mg(no3)2與al(no3)3或fe(no3)3在naoh溶液中反應，離心收集沉淀，將沉淀在反應釜中加熱，獲得mgal或mgfe層狀雙金屬氫氧化物納米粒；

8、4）將合成的dsrna與層狀雙金屬氫氧化物納米粒共孵育，離心收集沉淀，即得用于防治刺吸式害蟲的dsrna納米核酸殺蟲劑。

9、其中，所述引物的擴增產(chǎn)物序列如seq?id?no.1、2、3所示，分別為 pcchs、dcchs、 agchs基因。

10、其中，所述t7?啟動子的序列如seq?id?no.4所示。

11、其中，所述dsrna與層狀雙金屬氫氧化物納米粒的質(zhì)量比為1：1-11。

12、優(yōu)選地，所述靶向柑橘全爪螨、柑橘木虱、棉蚜 chs基因的dsrna（分別簡稱dspcchs、dsdcchs、dsagchs）與mgal層狀雙金屬氫氧化物納米粒的質(zhì)量比分別為1:?5、1:?7和1:?9；與mgfe層狀雙金屬氫氧化物納米粒的質(zhì)量比分別為1:?7、1:?7和1:?9。

13、向刺吸式害蟲的寄主植物施用所述的dsrna納米核酸殺蟲劑，被刺吸式害蟲誘食后干擾 chs基因的正常表達而促進死亡。本發(fā)明制備的dsrna納米核酸殺蟲劑在刺吸式害蟲治理中有較好的應用前景。

14、本發(fā)明的有益效果是：

15、本發(fā)明制備的核酸殺蟲劑克服了植物表面和細胞壁施加的屏障阻礙，能夠穿透植物表皮進入體液循環(huán)，從而被刺吸式害蟲取食并干擾 chs基因表達，在此基礎上，本發(fā)明證實了 pcchs、 dcchs和 agchs基因的沉默促進了柑橘全爪螨、柑橘木虱和棉蚜的死亡。本發(fā)明構建的dsrna投遞體系顯著提升了dsrna對刺吸式害蟲靶標基因的干擾效率，提高了刺吸式害蟲的死亡率，實現(xiàn)了對刺吸式害蟲的高效綠色防控。本發(fā)明還具有生物相容性好、dsrna穩(wěn)定性高等優(yōu)點，可廣泛應用于其它刺吸式害蟲的防控。