本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)領(lǐng)域，特別涉及一種表達(dá)ibv?s蛋白的基因vii型ndv重組病毒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、禽傳染性支氣管炎(?infectious?bronchitis，ib?)是一種由禽傳染性支氣管炎病毒(?infectious?bronchitis?virus，ibv?)引起的雞呼吸道、生殖道和泌尿生殖道的高度接觸性傳染病。該病通常可引起雞眼鼻分泌物增加、喘息、咳嗽和打噴嚏等呼吸道癥狀，也可通過感染泌尿生殖道引起腎功能障礙和產(chǎn)蛋量下降，其中雛雞的死亡率很高，特別是感染ibv后會伴隨其他繼發(fā)性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響蛋用型和肉用型禽類的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2、s蛋白是ibv結(jié)構(gòu)蛋白中分子量最大的結(jié)構(gòu)蛋白，在沒有糖基化前s蛋白的分子量約為128-160?kda，經(jīng)過糖基化修飾后s蛋白的分子量可達(dá)150-200?kda。s蛋白含有病毒中和抗原表位，是宿主的主要保護(hù)性抗原。s蛋白的不斷進(jìn)化和變異給疫苗的研發(fā)帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。迄今為止，世界范圍內(nèi)基于s1基因已鑒定出9個(gè)基因型，較為流行的為qx型、mass型、tw型等，qx型是中國目前最主要的流行毒株。而國內(nèi)目前主要使用的ibv疫苗毒株主要為mass型弱毒疫苗，不能給近些年來不斷涌現(xiàn)的ibv變異株提供足夠的保護(hù)。因此開發(fā)一種能針對不同血清型的ibv新型疫苗迫在眉睫。

3、s蛋白屬于ⅰ型膜融合蛋白，當(dāng)s1與宿主細(xì)胞受體結(jié)合時(shí)會導(dǎo)致s蛋白從亞穩(wěn)定的構(gòu)象向超穩(wěn)定的構(gòu)象進(jìn)行轉(zhuǎn)變。而維持融合前的亞穩(wěn)定構(gòu)象有利于提高s蛋白的穩(wěn)定性，增加其免疫原性?，F(xiàn)有研究表明，將sars-cov-2的s蛋白中2或6個(gè)特定位點(diǎn)氨基酸突變?yōu)楦彼峄驅(qū)Ωチ治稽c(diǎn)進(jìn)行突變有助于形成s蛋白的亞穩(wěn)定構(gòu)象。

4、新城疫(?newcastle?disease，nd?)是由新城疫病毒(?newcastle?diseasevirus，ndv?)強(qiáng)毒株引起的一種急性、高度接觸性傳染病，該病可引起雞發(fā)生高度傳染性的呼吸道和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的不斷發(fā)展，新城疫病毒載體因具有方便大規(guī)模生產(chǎn)、免疫途徑方便、誘導(dǎo)良好的免疫反應(yīng)、只感染特定宿主，安全可靠等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于反向遺傳學(xué)系統(tǒng)中。目前預(yù)防nd的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗。滅活疫苗免疫劑量大且需多次免疫；而弱毒疫苗主要針對基因ⅱ型的ndv，與我國目前流行的基因ⅶ型ndv毒株不匹配，因此給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提出一種表達(dá)ibv?s蛋白的基因vii型?ndv重組病毒及其制備方法和應(yīng)用，通過將適應(yīng)細(xì)胞株的ibv-p65的s2區(qū)域與qx型ibv?mh20的s2區(qū)域進(jìn)行替換，拯救出重組病毒rdhn3mf-mh20s1-ibvs2；通過將h120-s蛋白上的第692位、第768位、第772位、第815位、第862位、第863位疏水性氨基酸均突變?yōu)楦彼嵴瘸鲋亟M病毒rdhn3mf-h120-s6p；在突變6個(gè)疏水性氨基酸為脯氨酸的基礎(chǔ)上，將第533位-第537位的氨基酸依次突變?yōu)楦拾彼?、絲氨酸、丙氨酸、絲氨酸后拯救出重組病毒rdhn3mf-h120-s6p-gsas。將拯救出的三株重組病毒分別感染bhk-21細(xì)胞，經(jīng)wb驗(yàn)證能檢測到s蛋白以及ndv全蛋白的高效表達(dá)。

2、第一方面，本發(fā)明提出一種表達(dá)ibv?s蛋白的基因vii型?ndv重組病毒的制備方法，所述方法包括：

3、在pbr322-dhn3mf病毒基因組的p基因和m基因之間插入經(jīng)修飾的s基因，得到重組病毒rdhn3mf-mh20s1-ibvs2、rdhn3mf-h120-s6p、rdhn3mf-h120-s6p-gsas中的任一種。

4、進(jìn)一步地，所述在pbr322-dhn3mf病毒基因組的p基因和m基因之間插入經(jīng)修飾的s基因的步驟包括：

5、將基因f1片段、基因f2片段、基因mh20s1-ibvs2片段或基因h120-s6p片段或基因h120-s6p-gsas片段、基因f3片段通過同源重組的方法得到三株重組質(zhì)粒，并分別將三株重組質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞得到三株重組病毒。

6、進(jìn)一步地，所述基因f1片段的序列如seq?id?no?：1所示；

7、所述基因f2片段的序列如seq?id?no?：2所示；

8、所述基因mh20s1-ibvs2片段的序列如seq?id?no?：3所示；

9、所述基因h120-s6p片段的序列如seq?id?no?：4所示；

10、所述基因h120-s6p-gsas片段的序列如seq?id?no?：5所示；

11、所述基因f3片段的序列如seq?id?no?：6所示。

12、進(jìn)一步地，所述基因f1片段的制備過程為：以pbr322-dhn3mf載體為模板用smai進(jìn)行酶切，得到f1片段；

13、所述基因f2片段的制備過程為：以pbr322-dhn3mf質(zhì)粒為模板用引物fdhn-smai-f1、fdhn-r1擴(kuò)增得到f2片段；引物fdhn-smai-f1、fdhn-r1如序列表seq?id?no：7～8所示；

14、所述基因mh20s1-ibvs2片段的制備過程為：以mh20的?cdna為模板用引物mh20-s-f1、mh20-s-r1擴(kuò)增得到mh20-s1片段；以pxj40-ibv-s載體為模板用引物ibv-s2-f1、ibv-s2-r2擴(kuò)增得到ibv-s2片段；以mh20-s1、ibv-s2片段為模板用引物mh20-s-f1、ibv-s2-r2擴(kuò)增得到mh20s1-ibvs2片段。引物mh20-s-f1、mh20-s-r1、ibv-s2-f1、ibv-s2-r2如序列表seqid?no：9～12所示。

15、進(jìn)一步地，所述基因h120-s6p片段的制備過程為：以pxj40-h120-s2p質(zhì)粒為模板用引物h120-s-f1、h120-6p-r1擴(kuò)增得到h120-1片段；用引物h120-6p-f2、h120-6p-r2擴(kuò)增得到h120-2片段；用引物h120-6p-f3、h120-6p-r3擴(kuò)增得到h120-3片段；用引物h120-6p-f4、h120-s-r擴(kuò)增得到h120-4片段；以片段h120-1、h120-2、h120-3、h120-4為模板用引物h120-s-f1、h120-s-r擴(kuò)增得到h120-s6p片段。引物h120-s-f1、h120-6p-r1、h120-6p-f2、h120-6p-r2、h120-6p-f3、h120-6p-r3、h120-6p-f4、h120-s-r分別如序列表seq?id?no：13～20所示；

16、所述基因h120-s6p-gsas片段的制備過程為：以rdhn3mf-h120-s6p質(zhì)粒為模板用引物h120-s-f1、gsas-r1擴(kuò)增得到gsas-1片段；用引物gsas-f1、h120-s-r擴(kuò)增得到gsas-2片段；以gsas-1片段、gsas-2片段為模板分用引物h120-s-f1、h120-s-r擴(kuò)增得到h120-s6p-gsas片段。引物gsas-r1、gsas-f1分別如序列表seq?id?no：21～22所示；

17、所述基因f3片段的制備過程為：以pbr322-dhn3mf質(zhì)粒為模板用引物fdhn-f2、fdhn-smai-r2擴(kuò)增得到f3片段；引物fdhn-f2、fdhn-smai-r2分別如序列表seq?id?no：23～24所示。

18、進(jìn)一步地，重組過程中各物質(zhì)用量為：870ng基因片段f1、201ng基因片段f2、455ng基因片段mh20s1-ibvs2或450ng基因片段h120-s6p或450ng基因片段h120-s6p-gsas、611ng基因片段f3、10μl?abclonal?2x?multif?seamless?assembly?mix，ddh2o添加至20μl；反應(yīng)條件為50℃反應(yīng)50分鐘。

19、進(jìn)一步地，轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為bhk-t7細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染試劑的各組分如下：

20、a液：opti-mem?medium?100μl,?lipomaster?2000?transfection?reagent?18μl；

21、b液：opti-mem?medium?100μl，rdhn3mf-mh20s1-ibvs2或rdhn3mf-h120-s6p；rdhn3mf-h120-s6p-gsas?4μg?，pxj40-np?2.5μg，pxj40-p?1.25μg，pxj40-l?1.25μg。

22、第二方面，本發(fā)明還提出一種表達(dá)ibv?s蛋白的基因vii型?ndv重組病毒，根據(jù)上述的表達(dá)ibv?s蛋白的基因vii型?ndv重組病毒的制備方法獲得。

23、第三方面，本發(fā)明還提出一種表達(dá)ibv?s蛋白的基因vii型?ndv重組病毒在制備疫苗當(dāng)中的應(yīng)用。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

25、通過將不同基因型的ibv?s蛋白經(jīng)過改造，包括將適應(yīng)細(xì)胞株的ibv-p65的s2與非細(xì)胞適應(yīng)株mh20的s2進(jìn)行替換，突變h120?s蛋白中的6個(gè)疏水性氨基酸為脯氨酸并在此基礎(chǔ)上對弗林位點(diǎn)進(jìn)行突變，拯救出的重組病毒相比插入未經(jīng)改造的s蛋白的重組毒株要更加穩(wěn)定，這三株重組病毒有望進(jìn)一步開發(fā)成抗禽支氣管炎病毒和抗新城疫病毒的二聯(lián)疫苗，為控制禽支氣管炎病毒和新城疫病毒感染提供新的防御手段。