本發(fā)明涉及生物檢測，具體涉及一種用于檢測dna酶單鏈水解活性的熒光探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、dna酶即脫氧核糖核酸酶（dnase）普遍存在于細(xì)胞中，參與了多種生理生化過程，例如dna復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞凋亡等，其也可用作疾病的標(biāo)志物，如在關(guān)節(jié)炎、腎炎患者體內(nèi)dna酶i表達(dá)水平低，還可用于疾病的治療，如將dnase?i用于治療囊性纖維瘤。

2、dna酶主要通過催化dna分子主鏈中的磷酸二酯鍵對各種dna鏈進(jìn)行切割，是生物過程的重要參與者，也是研究生物機(jī)理的一類重要的水解酶。

3、近年來，研究最多的dna酶是dna酶ⅰ（dnase?i）。dnase?i可水解dna，產(chǎn)生具有5’-磷酸和3’-羥基基團(tuán)的單核苷酸和寡聚脫氧核糖核苷酸。dnase?i的水解活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活，鎂離子存在條件下，dnase?i可隨機(jī)剪切雙鏈dna的任意位點(diǎn)，而在二價(jià)錳離子存在條件下，dnase?i可在同一位點(diǎn)剪切dna雙鏈，形成平末端或1~2個(gè)核苷酸突出的粘末端。dnase?i除了具有雙鏈dna水解活性以外，還具有單鏈dna水解活性。

4、dna酶在環(huán)境和生物體內(nèi)無處不在，同時(shí)也成為許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室非常關(guān)注的質(zhì)控問題，主要原因在于dna酶的存在會(huì)降解dna分子，容易造成含有dna的實(shí)驗(yàn)樣品降解或污染，進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的丟失，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程并造成時(shí)間和金錢的浪費(fèi)，因而dna酶活性檢測是生物制品、實(shí)驗(yàn)試劑以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等的關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)。

5、目前有多種方法對dnase?i水解活性進(jìn)行檢測，但是，由于dnase?i既可以水解單鏈dna，也可以水解雙鏈dna，現(xiàn)有的dnase?i水解活性檢測方法無法將dnase?i的單鏈dna水解活性與雙鏈dna水解活性很好地進(jìn)行區(qū)分。因此，急需尋找一種能夠?qū)na酶單鏈水解活性進(jìn)行定量檢測且操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有的dna酶活性檢測方法難以區(qū)分dna酶的單鏈dna水解活性與雙鏈dna水解活性的問題，提高dna酶單鏈水解活性檢測靈敏度和準(zhǔn)確性，本發(fā)明提供一種用于檢測dna酶單鏈水解活性的熒光探針及其應(yīng)用。

2、根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種用于檢測dna酶單鏈水解活性的熒光探針，該熒光探針為單鏈dna結(jié)構(gòu)，熒光探針含有一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的距離為5~15?bp。

3、本發(fā)明基于熒光型rpa（重組酶聚合酶擴(kuò)增）體系通用型熒光探針設(shè)計(jì)，以單鏈dna為基礎(chǔ)，通過在單鏈dna上同時(shí)插入一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)（單淬滅基團(tuán)）并將熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)二者之間的距離控制在5~15?bp范圍之內(nèi)，通過上述設(shè)計(jì)得到本發(fā)明提供的熒光探針，將該熒光探針應(yīng)用于dna酶單鏈水解活性的檢測中，當(dāng)待測樣品中不含dna酶或含有的dna酶不具有單鏈dna水解活性時(shí)，該熒光探針的結(jié)構(gòu)保持完整，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離較近，無熒光信號產(chǎn)生，當(dāng)待測樣品中含有dna酶且dna酶具有單鏈dna水解活性時(shí)，具有單鏈dna水解活性的dna酶能夠水解熒光探針，使得熒光探針被酶切斷裂并解離出淬滅基團(tuán)，未淬滅的熒光基團(tuán)由于距離淬滅基團(tuán)較遠(yuǎn)而發(fā)出熒光信號，因而通過對檢測體系中的熒光信號進(jìn)行檢測能夠?qū)崿F(xiàn)對待測樣品中的dna酶單鏈水解活性進(jìn)行檢測的目的。并且，本發(fā)明提供的熒光探針具有單淬滅基團(tuán)結(jié)構(gòu)且淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)之間具有一定的空間距離，更加符合dna酶活性中的單鏈dna水解特性，解決了單鏈狀態(tài)下熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相距太遠(yuǎn)而導(dǎo)致檢測過程中背景底噪過高的問題，并在一定程度上減少了因水解不徹底而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，本發(fā)明提供的熒光探針對具有單鏈dna水解活性的dna酶具有特異性，能夠?qū)na酶單鏈水解活性進(jìn)行特異性檢測，檢測靈敏度高，單鏈dna水解活性最低檢測下限低至0.0006?u/μl。

4、5?bp是具有單鏈dna水解活性的dna酶能作用于單鏈dna的最短長度，若熒光探針中的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的距離＜5?bp，則會(huì)導(dǎo)致待測樣品中的具有單鏈dna水解活性的dna酶無法作用于熒光探針，使得熒光探針中的淬滅基團(tuán)難以從熒光探針上解離，熒光探針的結(jié)構(gòu)保持完整，熒光基團(tuán)因與淬滅基團(tuán)之間的距離較近而被淬滅，不會(huì)產(chǎn)生熒光信號，最終導(dǎo)致該熒光探針無法用于對dna酶單鏈水解活性進(jìn)行有效檢測，降低了dna酶單鏈水解活性檢測的準(zhǔn)確性；若熒光探針中的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的距離＞15?bp，在利用該熒光探針對dna酶單鏈水解活性進(jìn)行檢測的過程中會(huì)出現(xiàn)檢測底噪過高的問題，進(jìn)而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5、優(yōu)選地，熒光探針的長度為12~18?bp。

6、將熒光探針的長度控制在12~18?bp范圍之內(nèi)，在利用該熒光探針對dna酶單鏈水解活性進(jìn)行檢測過程中能夠降低底噪，進(jìn)而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

7、優(yōu)選地，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的距離為15?bp。

8、優(yōu)選地，熒光基團(tuán)位于熒光探針的5’端，淬滅基團(tuán)位于熒光探針的3’端，或，熒光基團(tuán)位于熒光探針的3’端，淬滅基團(tuán)位于熒光探針的5’端。

9、優(yōu)選地，熒光基團(tuán)位于熒光探針的5’端，淬滅基團(tuán)位于熒光探針的3’端。

10、與將熒光基團(tuán)和/或淬滅基團(tuán)插入到熒光探針的中間相比，將熒光基團(tuán)和/或淬滅基團(tuán)插入到熒光探針的兩端，能夠降低熒光探針的合成成本，進(jìn)而降低dna酶單鏈水解活性的檢測成本。

11、優(yōu)選地，熒光基團(tuán)選自fam、rox、joe、cy5、vic中的其中一種。

12、優(yōu)選地，淬滅基團(tuán)選自nfq、bhq1、bhq2、tamra中的其中一種。

13、優(yōu)選地，熒光基團(tuán)為fam，淬滅基團(tuán)為bhq1。

14、優(yōu)選地，熒光探針的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

15、根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供一種檢測dna酶單鏈水解活性的方法，包括以下步驟：將待測樣品與上述用于檢測dna酶單鏈水解活性的熒光探針進(jìn)行孵育，采集熒光信號，根據(jù)熒光信號的強(qiáng)度判斷待測樣品中的dna酶單鏈水解活性。

16、將本發(fā)明提供的熒光探針應(yīng)用于dna酶單鏈水解活性的檢測中，通過對檢測體系中的熒光信號的強(qiáng)度進(jìn)行檢測能夠?qū)崿F(xiàn)對dna酶單鏈水解進(jìn)行檢測的目的，該檢測dna酶單鏈水解活性的方法可在1小時(shí)之內(nèi)檢測出微量的具有dna單鏈水解活性的dna酶，檢測靈敏度高，簡單快捷，結(jié)果可靠，且該方法可以簡單、方便、快速實(shí)現(xiàn)對dna酶單鏈水解活性進(jìn)行檢測的目的，也可以用于檢測dna酶的污染水平，能夠?qū)na酶的單鏈水解活性與雙鏈水解活性進(jìn)行區(qū)分，解決了現(xiàn)有技術(shù)中無法特異性確定dna酶的單鏈dna水解活性的問題。

17、優(yōu)選地，用于檢測dna酶單鏈水解活性的熒光探針的濃度為0.1~10?μmol/l。

18、優(yōu)選地，孵育操作的溫度為25~45℃，時(shí)間為10~60?min。

19、優(yōu)選地，采集熒光信號的方法包括熒光定量pcr儀信號采集法、微孔酶標(biāo)儀信號采集法、分光光度計(jì)熒光信號采集法。

20、根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供一種用于檢測dna酶單鏈水解活性的試劑盒，該試劑盒包括上述用于檢測dna酶單鏈水解活性的熒光探針。