本發(fā)明涉及醫(yī)用高分子生物材料，尤其涉及一種可注射性的硫酸軟骨素基水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來，水凝膠因其高度的結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)性、良好的生物降解性、機(jī)械性能可調(diào)性等優(yōu)點(diǎn)而被應(yīng)用于組織填充、止血、組織修復(fù)和載藥等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。根據(jù)成膠方式不同，水凝膠大體可分為預(yù)制成形型水凝膠和可注射水凝膠。其中，可注射水凝膠是指可以通過原位聚合或溶膠-凝膠相變成膠的水凝膠?？勺⑸渌z的優(yōu)點(diǎn)包括對機(jī)體產(chǎn)生的傷害微小、適用于不規(guī)則和深部傷口、使用方法簡單，因而受到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域越來越多的關(guān)注。

2、硫酸軟骨素(chondroitin?sulfate，cs)是存在于人和動物結(jié)締組織中的酸性黏多糖，由d-葡糖醛酸和n-乙酰-d-氨基半乳糖以1,3苷鍵連接形成二糖，二糖之間以β-1,4苷鍵連接而成。cs具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗凝血和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，另外cs作為天然多糖類產(chǎn)物表現(xiàn)出來良好的生物相容性和生物降解性能。鑒于以上諸多優(yōu)點(diǎn)，以cs為材料的水凝膠被大量開發(fā)出來應(yīng)用于載藥、組織填充、組織修復(fù)等生物醫(yī)藥領(lǐng)域。但是，cs基水凝膠在應(yīng)用中多存在穩(wěn)定性不高、適用性較低以及含有毒性交聯(lián)劑殘留等問題，限制了其應(yīng)用和發(fā)展。

3、現(xiàn)有技術(shù)中提供了一些硫酸軟骨素的水凝膠產(chǎn)品，例如：中國發(fā)明專利cn115429935a公開了一種可注射性的交聯(lián)硫酸軟骨素水凝膠，cn116570554a公開了一種可注射凝膠，然而，上述方案中的水凝膠，其交聯(lián)作用力除氫鍵外，化學(xué)鍵分別為亞胺鍵和碳氮希夫動態(tài)鍵，均屬于動態(tài)共價(jià)鍵，在外界刺激下易發(fā)生斷裂，不利于提高其在人體內(nèi)的穩(wěn)定性；中國發(fā)明專利cn111499889a公開了一種硫酸軟骨素鎂透明質(zhì)酸水凝膠，然而，該水凝膠存在含有醛基的毒性交聯(lián)劑殘留、生物降解困難的問題，并且其僅采用包裹的形式負(fù)載藥物，使得藥物的釋放速度和穩(wěn)定性均受影響；中國發(fā)明專利cn118255909a公開了一種載藥硫酸軟骨素基凝膠，然而，該水凝膠屬于預(yù)制成形型水凝膠，不適用于制成注射型試劑，在不規(guī)則傷口和深部傷口中的應(yīng)用受到限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對目前硫酸軟骨素基水凝膠在生物體內(nèi)穩(wěn)定性差、毒性交聯(lián)劑殘留和傷口形狀適應(yīng)性差等問題，本技術(shù)提供了一種可注射、原位成膠和使用方法簡便的硫酸軟骨素基水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

2、一方面，本技術(shù)提供了一種可注射性的硫酸軟骨素基水凝膠，所述水凝膠具有如式(i)所示結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物：

3、

4、式(i)中，(x+m+n)＝100～10000，(q+w)＝100～10000。

5、可以理解的是，結(jié)構(gòu)式(i)的下角標(biāo)x、m、n、q、w均為正整數(shù)。

6、在一種實(shí)施方式中，所述水凝膠還包括通過與式(i)所示結(jié)構(gòu)中的任意基團(tuán)以共價(jià)鍵形式結(jié)合的活性物質(zhì)和/或藥物。

7、在一種實(shí)施方式中，所述活性物質(zhì)和/或藥物采用化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有氨基的物質(zhì)，進(jìn)而能夠與式(i)所示結(jié)構(gòu)中的琥珀酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵，以將活性物質(zhì)和/或藥物固定在式(i)所示交聯(lián)聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，實(shí)現(xiàn)聚合物和藥物組分之間相較于物理包裹或動態(tài)結(jié)合負(fù)載等形式更加穩(wěn)定的結(jié)合，同時(shí)有利于藥物組分的釋放速度和效果，達(dá)到更好的緩釋效果。

8、優(yōu)選的，所述活性物質(zhì)和/或藥物可以是含有氨基的多肽或蛋白質(zhì)。

9、可選的，所述水凝膠可以同時(shí)采用物理包裹或動態(tài)結(jié)合負(fù)載等形式與藥物和/或藥學(xué)上可以接受的輔料進(jìn)行混合，制成水凝膠制劑或組合物，具體可以采用本領(lǐng)域已知的藥學(xué)組分或方法。

10、另一方面，本技術(shù)提供了所述硫酸軟骨素基水凝膠的制備方法，所述方法包括：

11、s1、將硫酸軟骨素和n-羥基琥珀酰亞胺在脫水劑1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽的作用下發(fā)生酯化反應(yīng)，制得琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素；

12、s2、將s1獲得的琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素配制成琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素溶液，和羧甲基殼聚糖溶液混合后凝膠化，形成所述硫酸軟骨素基水凝膠。

13、在一種實(shí)施方式中，步驟s1制得的琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素具有如式(ii)所示結(jié)構(gòu)：

14、

15、式(ii)中n取值≥100，m取值為≥10。

16、其中，具有上述結(jié)構(gòu)的琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素，使得硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)中含有一定量的琥珀酰亞胺基團(tuán)占比以及特定的分子量，而琥珀酰亞胺的接枝率與最終和羧甲基殼聚糖混合后的成膠速度和成膠強(qiáng)度密切相關(guān)，適量的琥珀酰亞胺接枝率能夠在后續(xù)混合成膠時(shí)較多的被羧甲基殼聚糖取代，同時(shí)在化學(xué)動力學(xué)下仍保留部分琥珀酰亞胺的取代基團(tuán)，進(jìn)而形成如式(i)所示的交聯(lián)聚合物。

17、在一種實(shí)施方式中，所述琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素的分子量為50000～5000000，例如可以是50000、100000、200000、400000、600000、800000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000。

18、在一種實(shí)施方式中，所述羧甲基殼聚糖具有如式(ⅱi)所示結(jié)構(gòu)：

19、

20、優(yōu)選的，所述羧甲基殼聚糖的分子量為50000～5000000，例如可以是50000、100000、200000、400000、600000、800000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000。

21、在一種實(shí)施方式中，所述s1中，硫酸軟骨素、1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的反應(yīng)摩爾比為1：(0.1～10)：(0.1～10)，例如可以是1：0.1：0.1、1：0.2：0.2、1：0.4：0.1、1：0.8：0.8、1：1：1、1：2：2、1：4：4、1：8：8、1：10：10、1：2：4、1：2：8、1：2：10。

22、優(yōu)選的，硫酸軟骨素和nhs的投料摩爾比為1：(0.1～9)，更優(yōu)選1：(0.5～8)，例如1:0.5、1：1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8，更優(yōu)選1:2。

23、在一種實(shí)施方式中，所述反應(yīng)的條件為：于ph值為4～6的pbs緩沖溶液中攪拌反應(yīng)1～60min，反應(yīng)溫度0℃～55℃。

24、優(yōu)選的，反應(yīng)溫度為20～35℃，更優(yōu)選25℃；反應(yīng)時(shí)間5～30min，更優(yōu)選10min。

25、在一種實(shí)施方式中，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液倒入-30～-10℃的無水乙醇中獲得沉淀，將所述沉淀過濾、洗滌、干燥，即得所述琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素。

26、優(yōu)選的，所述無水乙醇的溫度的-20℃。

27、在一種實(shí)施方式中，所述反應(yīng)液與無水乙醇體積比為1：(0.5～100)。

28、在一種實(shí)施方式中，所述沉淀過濾完成后使用無水乙醇進(jìn)行洗滌，洗滌次數(shù)為1-50次。

29、在一種實(shí)施方式中，所述沉淀洗滌后置于真空干燥器內(nèi)干燥2～24h。

30、在一種實(shí)施方式中，所述琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素制備后溶解前進(jìn)行冷凍儲存，冷凍條件為：于-196℃～0℃冷凍儲存。

31、在一種實(shí)施方式中，所述s2中，琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素和羧甲基殼聚糖的混合質(zhì)量比為(5～0.5)：(0.5～5)。例如可以是(5～1)：(1～5)，優(yōu)選為(3～1)：(1～3)，還可以是3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，更優(yōu)選為1:1。

32、在一種實(shí)施方式中，配制溶液所用的溶劑選自生理鹽水、pbs緩沖液、超純水中的一種或多種，優(yōu)選為生理鹽水。

33、在一種實(shí)施方式中，琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素溶液的配制濃度為0.1％～25％，羧甲基殼聚糖溶液的配制濃度為0.1％～25％。

34、可選的，琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素和羧甲基殼聚糖溶液的配制濃度可以是0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、15.0％、20％和25％等，混合時(shí)可以是等體積混合，也可以是按比例混合，最終溶液中琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素和羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比為需求質(zhì)量比即可。

35、在一種實(shí)施方式中，所述s2中混合的方法包括：將琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素溶液和羧甲基殼聚糖溶液，通過注射器的同一注射口擠出進(jìn)行混合。

36、例如，可以是將兩溶液分別裝至雙針管注射器的兩個(gè)注射管內(nèi)，再通過同一注射口擠出進(jìn)行混合。

37、在一種實(shí)施方式中，所述s2中，凝膠化的成膠時(shí)間為1～600s。

38、優(yōu)選的，所述硫酸軟骨素基水凝的平均成膠時(shí)間為10～200s，更優(yōu)選20～60s。

39、在一種實(shí)施方式中，注射混合過程在室溫下完成。

40、在一種實(shí)施方式中，所述硫酸軟骨素基水凝膠注射過程流暢，無阻力。

41、另一方面，本技術(shù)還提供了所述可注射性硫酸軟骨素基水凝膠，或所述方法制備獲得的可注射性硫酸軟骨素基水凝膠在制備創(chuàng)傷輔助治療產(chǎn)品中的應(yīng)用。

42、在一種實(shí)施方式中，所述創(chuàng)傷輔助治療產(chǎn)品包括用于組織創(chuàng)傷或缺損的填充劑、止血和傷口的防護(hù)用品、組織封閉用品、藥物遞送用品、生物支架、注射型細(xì)胞遞送材料、組織工程材料、細(xì)胞三維培養(yǎng)材料、醫(yī)療美容填充材料。

43、在一種實(shí)施方式中，還可以根據(jù)實(shí)際的應(yīng)用場景，向本技術(shù)提供的硫酸軟骨素基水凝膠中加入本領(lǐng)域的常規(guī)添加組分，或者添加其他活性功效成分以使其具體其他活性功效。

44、在一種實(shí)施方式中，所述硫酸軟骨素基水凝膠具有良好的生物相容性和生物降解性能。

45、在一種實(shí)施方式中，所述硫酸軟骨素基水凝膠適用于不規(guī)則和深部傷口的處理和填充。

46、在一種實(shí)施方式中，所述可注射性硫酸軟骨素基水凝膠適用于創(chuàng)傷深度不低于1mm的傷口。

47、在一種實(shí)施方式中，所述傷口為缺損性傷口，包括由于意外創(chuàng)傷導(dǎo)致或手術(shù)中出現(xiàn)的軟組織缺損。

48、可選的，所述器官可以是皮膚、肝臟、脾臟、腎臟、胃腸或心臟。

49、在一種實(shí)施方式中，所述硫酸軟骨素基水凝膠的使用方法如下：

50、對于不規(guī)則或深部傷口組織，將琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素和羧甲基殼聚糖配制成相應(yīng)溶液并分裝至雙針管注射器的兩個(gè)針管內(nèi)；將溶液注射至傷口表面或注射填充至深部傷口，或注射填充至缺損組織的缺損位置，等待幾秒至幾十秒后，混合液原位形成水凝膠，完成對傷口的填充與覆蓋。

51、本技術(shù)至少具有如下技術(shù)優(yōu)勢或效果：

52、1、本技術(shù)在研制過程中發(fā)現(xiàn)，單一的將硫酸軟骨素和羧甲基殼聚糖進(jìn)行溶解后混合并不能形成凝膠，而本技術(shù)通過酯化反應(yīng)將適量的琥珀酰亞胺基枝接至硫酸軟骨素分子中合成琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素，并將琥珀酰亞胺功能化硫酸軟骨素和羧甲基殼聚糖再分別溶解后混合，能夠通過共價(jià)鍵原位交聯(lián)形成水凝膠，并且該水凝膠適用于針管注射器進(jìn)行混合注射。該硫酸軟骨素基水凝膠制備方法簡單、原料廉價(jià)易得，并且，該硫酸軟骨素基水凝膠還可以通過控制琥珀酰亞胺基團(tuán)的接枝數(shù)量調(diào)節(jié)成膠速度，并具有適用于不規(guī)則和深部傷口以及使用方法簡便的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷管理領(lǐng)域。

53、2、本技術(shù)提供的硫酸軟骨素基水凝膠的制備和使用方法中，原料合成、配膠工藝簡單，使用方法簡便，適用范圍廣泛；并且，硫酸軟骨素基水凝膠僅包含兩個(gè)組分，成分簡單，制備硫酸軟骨素基水凝膠的過程僅需經(jīng)過溶解和注射混合，工藝簡單。并且，所制備硫酸軟骨素基水凝膠使用方法簡單，不需要復(fù)雜的器械和繁雜的操作步驟。

54、3、本技術(shù)提供的硫酸軟骨素基水凝膠中的琥珀酰亞胺基功能化硫酸軟骨素，一方面與羧甲基殼聚糖共價(jià)交聯(lián)形成水凝膠；另一方面，如式(i)所示的水凝膠結(jié)構(gòu)中含有部分未被羧甲基殼聚糖取代的琥珀酰亞胺基團(tuán)，該琥珀酰亞胺基團(tuán)在提高凝膠一定機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí)，還可與含氨基活性物質(zhì)或藥物發(fā)生結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合，以在水凝膠在傷口處降解的過程中實(shí)現(xiàn)藥物的緩慢釋放。

55、4、本技術(shù)提供的硫酸軟骨素基水凝膠還具有良好的細(xì)胞相容性、生物降解性能和血液相容性，使用更加安全、生物相容性好，并且凝膠化后游離出的nhs也具有較好的生物相容性。本技術(shù)中所提供的水凝膠成膠過程中不再額外的增加例如含有醛基的毒性交聯(lián)劑，不存在毒性交聯(lián)劑殘留和降解困難的問題。

56、5、本技術(shù)提供的制備獲得的硫酸軟骨素基水凝膠，含有的硫酸軟骨素具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的活性，羧甲基殼聚糖具有抗菌活性，兩組分所具備的生物活性均有利于促進(jìn)傷口的愈合，適用于創(chuàng)傷部位的填充修復(fù)。

57、6、本技術(shù)提供的制備獲得的硫酸軟骨素基水凝膠，交聯(lián)聚合物中的琥珀酰亞胺基團(tuán)和羧甲基殼聚糖均以酯鍵和硫酸軟骨素共價(jià)結(jié)合，相較于氫鍵或動態(tài)化學(xué)鍵具有更好的穩(wěn)定性，并且羧甲基殼聚糖除具有很好的生物相容性和安全性外，其結(jié)構(gòu)中還含有大量的氨基，能夠進(jìn)一步與未被取代的琥珀酰亞胺基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，進(jìn)而形成穩(wěn)定的三維交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于在創(chuàng)傷處長時(shí)間發(fā)揮活性功效；與此同時(shí)，該水凝膠具有快速且合適的成膠時(shí)間，在使用時(shí)能夠迅速對創(chuàng)口進(jìn)行填充且不封堵注射口，顯著提高使用的便捷性和利用率。