本發(fā)明屬于干細(xì)胞領(lǐng)域，具體地說，涉及一種豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞培養(yǎng)肉是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)來獲得肉類的方式。目前所用細(xì)胞主要為肌肉干細(xì)胞，但是肌肉干細(xì)胞增殖幾代后分化為骨骼肌細(xì)胞的能力就顯著下降，不利于大規(guī)模擴(kuò)增。而多能干細(xì)胞具有無限增殖的特性，目前關(guān)于多能干細(xì)胞分化骨骼肌細(xì)胞已有多項(xiàng)研究。主要方式有兩種：第一種是基因方式通過過表達(dá)pax7或者myod1誘導(dǎo)得到骨骼肌細(xì)胞，第二種是小分子化合物方式通過小分子化合物的組合來實(shí)現(xiàn)多能干細(xì)胞分化骨骼肌細(xì)胞。雖然都能獲得骨骼肌細(xì)胞，但是小分子化合物方式的效率卻遠(yuǎn)低于基因方式?，F(xiàn)在基因方式的研究多是集中在人類的多能干細(xì)胞用于治療肌肉相關(guān)的疾病，對于豬的多能干細(xì)胞研究較少，同時(shí)目前的研究主要在于獲得骨骼肌細(xì)胞，對于成本的考慮較少，而細(xì)胞肉要想實(shí)現(xiàn)規(guī)?；慨a(chǎn)必須解決種子細(xì)胞來源和培養(yǎng)基成本的問題。因此有必要去研究如何誘導(dǎo)豬的多能干細(xì)胞分化為骨骼肌細(xì)胞，同時(shí)還能低成本。

2、cn110564676a公開了一種人多能干細(xì)胞快速分化為骨骼肌細(xì)胞的方法，旨在解決多能干細(xì)胞誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞時(shí)間長、效率低的問題。具體包括向培養(yǎng)基中的多能干細(xì)胞中引入含有至少一種潛能基因的表達(dá)載體，從而將所述多能干細(xì)胞定向分化為骨骼肌細(xì)胞。通過在誘導(dǎo)人的多能干細(xì)胞向骨骼肌細(xì)胞定向分化的不同階段，特異誘導(dǎo)mef2b、pax3、pax7、mydo1、pitx1、myogenin、mef2c、mrf4、desmin中的一種或幾種不同組合基因的表達(dá)，獲得了純度高達(dá)80％的功能性的骨骼肌細(xì)胞，而且顯著縮短了誘導(dǎo)的周期。

3、cn104120106a公開了一種利用豬去分化脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成骨骼肌細(xì)胞的方法。本發(fā)明通過膠原酶消化法分離豬皮下脂肪組織的成熟脂肪細(xì)胞，去分化形成去分化脂肪細(xì)胞(dfat細(xì)胞)。dfat細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells，mscs)具有相似的功能特性，能夠在體外高效增殖和誘導(dǎo)多向分化。另外，本發(fā)明成功將豬dfat細(xì)胞在體外利用半乳糖凝集素-1(galectin-1)蛋白的誘導(dǎo)，分化形成能夠表達(dá)骨骼肌細(xì)胞特異性標(biāo)志分子的多核細(xì)胞。

4、綜上所述，現(xiàn)有的方法存在無明確的針對性解決大型肉畜胚胎干細(xì)胞如何快速誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞這一問題的方法，且存在單次獲取細(xì)胞后可培養(yǎng)代次少，無法支持細(xì)胞大量擴(kuò)增及儲備的缺陷。

5、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞的方法。

2、為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞的方法，其中，所述的方法包括如下步驟：

4、(1)構(gòu)建過表達(dá)pax7的豬胚胎干細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系；

5、(2)豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞；

6、(3)豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞免疫熒光鑒定；

7、其中，步驟(1)具體包括如下步驟：

8、1.1、構(gòu)建dox誘導(dǎo)的pax7表達(dá)質(zhì)粒piggybac-tre3g-ef1a-pax7；

9、1.2、對培養(yǎng)兩天的豬胚胎干細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)杯中加buffer?e；取buffer?r，混入質(zhì)粒piggybac-tre3g-ef1a-pax7和pbase，混勻后重懸細(xì)胞沉淀；

10、1.3、電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將細(xì)胞種到飼養(yǎng)層上，并在培養(yǎng)基中加入y-27632，第二天更換為不含y-27632的培養(yǎng)基；

11、1.4、培養(yǎng)3-4天后，挑取電轉(zhuǎn)成功的豬胚胎干細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，命名pax7-pescs，即為過表達(dá)pax7的豬胚胎干細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系。

12、進(jìn)一步地，步驟1.2中，質(zhì)粒piggybac-tre3g-ef1a-pax7和pbase的質(zhì)量比為2:1。

13、進(jìn)一步地，

14、步驟1.2中，電轉(zhuǎn)參數(shù)為：1200v，20ms，2pulse；

15、步驟1.2中，buffer?e的體積為3ml，buffer?r的體積為100μl；

16、步驟1.3中，加入的y-27632的終濃度為10μm。

17、進(jìn)一步地，步驟(2)具體包括如下步驟：

18、2.1、將獲得的pax7-pescs在培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天；

19、2.2、換成第一階段培養(yǎng)基培養(yǎng)17天；

20、2.3、換成第二階段培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；

21、2.4、換成第三階段培養(yǎng)基分化五天。

22、本發(fā)明中，步驟(2)還可以采用另一種方案，具體包括如下步驟：

23、2.1、將獲得的pax7-pescs在培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天；

24、2.2、換成第一階段培養(yǎng)基培養(yǎng)21天；

25、2.3、換成第二階段培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；

26、2.4、換成第三階段培養(yǎng)基分化一天，再將分化所得消化細(xì)胞種植到圖案化明膠支架上培養(yǎng)5天。

27、進(jìn)一步地，

28、所述第一階段培養(yǎng)基包括imdm、hs、penicillin-streptomycin、chir99021、sb431542、hr-egf、insulin、dexamethasone、l-抗壞血酸和y-27632；

29、所述第二階段培養(yǎng)基包括imdm、ksr、igf-1、forskolin、sb431542、dexamethasone、dapt和doxycycline?hyclate；

30、所述第三階段培養(yǎng)基包括imdm、ksr、igf-1、forskolin、sb431542、dexamethasone和dapt。

31、進(jìn)一步地，步驟2.4中，消化細(xì)胞的種植密度為按照每個(gè)4×4cm圖案化明膠支架種植6×106個(gè)細(xì)胞。

32、進(jìn)一步地，所述的圖案化明膠支架是利用fdm?3d打印技術(shù)制備得到的。

33、進(jìn)一步地，步驟(3)具體為：對豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行myhc表達(dá)情況的檢測。

34、進(jìn)一步地，所述的方法還包括步驟(4)，具體為：在豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞過程中進(jìn)行基因水平檢測。

35、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

36、本發(fā)明利用基因過表達(dá)操作及特定培養(yǎng)基的配合，實(shí)現(xiàn)了以豬為主的大型肉畜的胚胎干細(xì)胞快速分化為骨骼肌細(xì)胞的目標(biāo)。且在誘導(dǎo)豬胚胎干細(xì)胞分化后利用第一階段培養(yǎng)基將細(xì)胞維持在肌源性祖細(xì)胞狀態(tài)較長時(shí)間，在該階段可獲得極大的細(xì)胞儲備。通過更換第二、三階段培養(yǎng)基，肌源性祖細(xì)胞可隨時(shí)快速分化為骨骼肌細(xì)胞。

技術(shù)特征：

1.一種豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1.2中，質(zhì)粒piggybac-tre3g-ef1a-pax7和pbase的質(zhì)量比為2:1。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟2具體包括如下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟2具體包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2.4中，消化細(xì)胞的種植密度為按照每個(gè)4×4cm圖案化明膠支架種植6×106個(gè)細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的圖案化明膠支架是利用fdm?3d打印技術(shù)制備得到的。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3具體為：對豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行myhc表達(dá)情況的檢測。

10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括步驟(4)，具體為：在豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞過程中進(jìn)行基因水平檢測。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種豬胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞的方法。包括：(1)構(gòu)建過表達(dá)PAX7的豬胚胎干細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系；(2)誘導(dǎo)分化骨骼肌細(xì)胞；(3)免疫熒光鑒定；其中步驟(1)具體包括：1.1、構(gòu)建DOX誘導(dǎo)的PAX7表達(dá)質(zhì)粒PiggyBac?TRE3G?EF1a?PAX7；1.2、對培養(yǎng)兩天的豬胚胎干細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)杯中加Buffer?E；取Buffer?R，混入質(zhì)粒和PBase，混勻后重懸細(xì)胞沉淀；1.3、電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將細(xì)胞種到飼養(yǎng)層上，并在培養(yǎng)基中加入Y?27632，第二天更換為不含Y?27632的培養(yǎng)基；1.4、培養(yǎng)3?4天后，挑取電轉(zhuǎn)成功的豬胚胎干細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，命名PAX7?PESCs。

技術(shù)研發(fā)人員：賴良學(xué),米繼東,汪海,葉升,王美超
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京希諾谷生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30