本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，屬于肝癌檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，涉及檢測(cè)肝癌的甲基化標(biāo)志物、檢測(cè)試劑及檢測(cè)模型。

背景技術(shù)：

1、根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，原發(fā)性肝癌(plc)在所有惡性腫瘤中的發(fā)病率排名第六，死亡率排名第三。肝細(xì)胞癌(hcc)占所有plc病例的85％，患者的5年生存率較低(10％-19％)。全球有2.92億與hcc相關(guān)的死亡，其中一半以上與hbv感染相關(guān)，使hbv感染成為hcc癌變的主要因素。通過臨床觀察，臨床醫(yī)生已經(jīng)就hbv在肝病從肝炎進(jìn)展為肝硬化，并進(jìn)一步發(fā)展到hcc中的致病作用達(dá)成了共識(shí)。在診斷時(shí)，大多數(shù)hcc患者已經(jīng)處于c期或d期(巴塞羅那臨床肝癌[bclc]分期)，因此手術(shù)切除等根治性治療手段不再可行。相比之下，bclc?a期hcc的5年生存率可高達(dá)70％。血清甲胎蛋白(afp)試驗(yàn)聯(lián)合兩年一次的肝臟超聲是目前篩查高危患者h(yuǎn)cc的主要策略。然而，afp的準(zhǔn)確性較低，特異性為85％-90％，敏感性為18％-60％，對(duì)于早期肝腫瘤尤其效率較低。

2、表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展對(duì)肝癌的早期診斷和治療具有深遠(yuǎn)的意義。有證據(jù)表明抑癌基因啟動(dòng)子cpg島高度甲基化是基因失活的一個(gè)重要機(jī)制，不同基因的轉(zhuǎn)錄失活將影響細(xì)胞周期、dna修復(fù)、細(xì)胞凋亡等，與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系?；蚣谆侵竏na分子上cpg雙核苷中的胞嘧啶(c)在酶的作用下選擇性地添加甲基形成5’-甲基胞嘧啶的過程。在肝癌患者中，基因啟動(dòng)子區(qū)的cpg島甲基化是一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象。臨床認(rèn)為，對(duì)肝癌患者的組織細(xì)胞和體液進(jìn)行甲基化基因標(biāo)志物的檢測(cè)，是一項(xiàng)有效的肝癌輔助檢測(cè)方法，具有提高肝癌檢出率的價(jià)值。如果將其與細(xì)胞病理學(xué)的檢測(cè)結(jié)合起來，可大大提高肝癌診斷的效率，縮短檢測(cè)周期，提高診斷的準(zhǔn)確性。

3、因此，本領(lǐng)域需求一些標(biāo)志物，特別地，在早期肝癌中和就具有較好靈敏度和特異性的標(biāo)志物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，第一方面，本發(fā)明提供一種輔助檢測(cè)肝癌的甲基化標(biāo)志物：

2、chr1：34792772-34792982。

3、使用本發(fā)明的標(biāo)志物對(duì)肝癌檢測(cè)的靈敏度、特異性以及auc分別為83.33％、83.33％、0.833。本發(fā)明的標(biāo)志物僅需檢測(cè)標(biāo)志物210bp長(zhǎng)度(一個(gè)探針范圍)，就能夠在臨床上對(duì)肝癌進(jìn)行檢測(cè)，成本和時(shí)間均得到節(jié)約，并且能以高靈敏和高特異性將真正具有肝癌惡變風(fēng)險(xiǎn)的患者在癌變過程早期階段檢出，檢測(cè)性價(jià)比較高。

4、具體地，本發(fā)明的甲基化標(biāo)志物位于人類基因組1號(hào)染色體上第34792772位-第34792982位所示的序列，具體地，如下所示：

5、acctggtggagagagaacagaggagaggaagggtaggtcagcccctcttgcccctccccaccgcaaatcacacaggcccacctccccggagtgggtttagggagtctgcacctcccagtccccgcccccgccctctctccagcgcccgccgccctccccgtcgcgtttcctgcccccaccccgcccctctgcgctatttaaggcgccccc。

6、第二方面，本發(fā)明提供了一種輔助檢測(cè)肝癌的甲基化標(biāo)志物的組合物，所述組合物包括檢測(cè)以下區(qū)域中的甲基化水平的檢測(cè)試劑：

7、chr1：34792772-34792982。

8、其中，chr1：34792772-34792982所示為基因啟動(dòng)子區(qū)域中cpg島的一段區(qū)域。

9、在本發(fā)明中，“cpg島”是胞嘧啶(c)-磷酸(p)-鳥嘌呤(g)的縮寫，指的是基因組上富含cpg二核苷酸的一些區(qū)域，長(zhǎng)度為300～3000bp。

10、在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的檢測(cè)試劑，可以對(duì)樣本中所存在的相應(yīng)基因區(qū)域上的cpg島或者cpg島上的一段序列的甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)。

11、在本發(fā)明中，“樣本”為選自個(gè)體的生物樣本。具體地，例如，選自組織學(xué)切片、組織活檢/石蠟包埋的組織等。

12、在本發(fā)明中，“檢測(cè)試劑”指的是對(duì)樣本中的基因的甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)的試劑。其中，所述甲基化水平是通過擴(kuò)增-測(cè)序、芯片檢測(cè)、甲基化熒光定量pcr的方式測(cè)量。

13、在一些具體的實(shí)施方案中，所述甲基化水平的檢測(cè)試劑也可以是檢測(cè)基因片段的平均甲基化水平的檢測(cè)試劑。

14、在一些具體的實(shí)施方案中，所述甲基化水平的檢測(cè)試劑還可以是檢測(cè)基因區(qū)段內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)試劑。

15、在一些具體的實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑包括但不限于核酸引物、測(cè)序tag序列，用于通過擴(kuò)增-測(cè)序測(cè)量甲基化水平。

16、在一些具體的實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑包括但不限于芯片，所述芯片是甲基化芯片，所述甲基化芯片具有與甲基化區(qū)域特異性結(jié)合的探針。所述芯片用于測(cè)量甲基化水平。

17、在一些具體的實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑包括但不限于核酸引物以及核酸探針，用于通過甲基化熒光定量pcr測(cè)量甲基化水平。

18、進(jìn)一步地，所述檢測(cè)試劑還包括內(nèi)標(biāo)引物以及內(nèi)標(biāo)探針。

19、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，內(nèi)標(biāo)引物和探針的靶標(biāo)為actb基因。

20、當(dāng)所述檢測(cè)試劑包括核酸引物以及核酸探針時(shí)，所述檢測(cè)試劑通過甲基化熒光定量pcr對(duì)樣本中核酸的甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)。

21、在本發(fā)明中，“甲基化熒光定量pcr”是指將待檢測(cè)區(qū)域通過亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化或甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶酶切，再使用針對(duì)檢測(cè)靶標(biāo)特異性設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，從而得出所述待檢測(cè)區(qū)域的甲基化水平。

22、上述試劑組合還可以包括其余的試劑，具體地，例如，各種對(duì)樣本進(jìn)行前處理或者預(yù)處理所需要的試劑。例如，提取樣本核酸的樣本釋放劑，純化樣本核酸的純化劑，轉(zhuǎn)化所用的重亞硫酸鹽或亞硫酸氫鹽等。

23、第四方面，本發(fā)明提供了一種輔助檢測(cè)肝癌的模型，所述模型為：

24、hcc_score＝50+50*[(m-1/2*(n_m+c_m)]/[1/2*abs(c_m-n_m)]

25、其中，m是受檢者本發(fā)明所述的標(biāo)志物甲基化值，n_m是模型中健康人群甲基化均值為0.37，c_m是模型中肝癌患者甲基化均值為0.47。當(dāng)hcc_score>＝50,即預(yù)測(cè)受檢者患肝癌是高風(fēng)險(xiǎn)；hcc_score<50，預(yù)測(cè)受檢者患癌風(fēng)險(xiǎn)低，屬于健康人群。

26、第五方面，本發(fā)明提供一種設(shè)備，包括：

27、至少一個(gè)處理器；以及

28、與至少一個(gè)所述處理器通信連接的存儲(chǔ)器；其中，

29、所述存儲(chǔ)器存儲(chǔ)有可被所述處理器執(zhí)行的指令，所述指令用于被所述處理器執(zhí)行以實(shí)現(xiàn)上述任一項(xiàng)所述的輔助檢測(cè)肝癌的模型。

30、在一些實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括至少一個(gè)輸入設(shè)備和至少一個(gè)輸出設(shè)備；在所述設(shè)備中，所述處理器、存儲(chǔ)器、輸入設(shè)備、輸出設(shè)備之間通過總線連接。

31、第六方面，提供了一種存儲(chǔ)介質(zhì)，所述存儲(chǔ)介質(zhì)存儲(chǔ)有計(jì)算機(jī)指令，所述計(jì)算機(jī)指令用于被所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行以實(shí)現(xiàn)上述任一項(xiàng)所述的輔助檢測(cè)肝癌的模型。

32、在一些實(shí)施方案中，存儲(chǔ)介質(zhì)為計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。

33、第七方面，本發(fā)明提供一種裝置，包括

34、模型模塊，其用于執(zhí)行上述任一項(xiàng)所述的輔助檢測(cè)肝癌的模型；以及

35、檢測(cè)模塊，檢測(cè)chr1：34792772-34792982區(qū)域的甲基化水平。

36、第八方面，本發(fā)明提供了上述標(biāo)志物或模型在制備用于輔助檢測(cè)肝癌的試劑盒或者裝置中的用途。

37、進(jìn)一步地，所述輔助檢測(cè)肝癌的試劑盒或者裝置為使用血液樣本輔助檢測(cè)肝癌的試劑盒或裝置。

38、第九方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)肝癌的甲基化基因檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的組合物或者模型。

39、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括但不限于提取核酸的試劑、純化核酸的試劑、重亞硫酸鹽中的至少一種。

40、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括陰性樣本。

41、具體地，陰性樣本是經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無目標(biāo)基因甲基化的人基因組dna。

42、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括dntps、mg2+、甲基化敏感限制性內(nèi)切酶、pcr緩沖液、熱啟動(dòng)酶中的至少一種。

43、進(jìn)一步地，所述甲基化敏感限制性內(nèi)切酶包括hpaii、hinp1i和hhai中的至少一種。

44、進(jìn)一步地，各組分終濃度的范圍如下所示：mg2+1～6mm、dntps?1～80mm、甲基化敏感限制性內(nèi)切酶0.01～30u、引物0.1～40μm、探針0.1～20μm。