本發(fā)明提供了一種能修飾線粒體的融合蛋白，經(jīng)所述融合蛋白修飾的線粒體以及包含其作為活性成分的藥物組合物。

背景技術(shù)：

1、線粒體是真核細(xì)胞的細(xì)胞器，參與細(xì)胞內(nèi)能量來(lái)源-三磷酸腺苷(atp)的合成和調(diào)節(jié)。線粒體與體內(nèi)的多種代謝途徑相關(guān)，例如，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞死亡以及細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)的控制。線粒體具有自己的基因組，并且是在細(xì)胞的能量代謝中起著核心作用的細(xì)胞器。線粒體通過(guò)電子傳遞和氧化磷酸化過(guò)程產(chǎn)生能量，并在參與凋亡信號(hào)通路中起重要作用。

2、據(jù)報(bào)道，由于線粒體功能下降引起的能量產(chǎn)生的減少導(dǎo)致多種疾病。當(dāng)電子傳遞鏈反應(yīng)的功能由于線粒體基因組和蛋白質(zhì)組的變化而降低時(shí)，發(fā)生atp產(chǎn)生的降低、過(guò)量活性氧產(chǎn)生、鈣調(diào)節(jié)功能的降低等。在這種情況下，線粒體的膜通透性發(fā)生變化，并且凋亡功能可能異常發(fā)生，并導(dǎo)致癌癥和不治之癥。

3、因此，據(jù)報(bào)道由線粒體功能障礙導(dǎo)致的人類疾病包括與線粒體相關(guān)的遺傳疾病(wallace?dc?1999)、糖尿病(maechler?p?2001)、心臟病(sorescu?d?2002)、老年性癡呆(如帕金森氏病或阿爾茨海默氏病)(lin?mt?2006)、以及各種癌癥(petros?ja，2005)和癌癥轉(zhuǎn)移(ishikawa?k，2008)的發(fā)生等已見(jiàn)諸報(bào)道。此外，在超過(guò)200種類型的癌癥中發(fā)現(xiàn)的共同特點(diǎn)包括凋亡功能受損、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)和異常代謝增加。所有這些過(guò)程都與線粒體功能密切相關(guān)，癌癥與線粒體之間的相關(guān)性正在引起人們的注意。

4、另一方面，已知正常細(xì)胞每一分子葡萄糖通過(guò)一個(gè)電子傳遞系統(tǒng)過(guò)程產(chǎn)生36個(gè)atp，但是癌細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，在足夠氧氣的條件下，每一分子葡萄糖通過(guò)糖酵解產(chǎn)生2個(gè)atp(有氧糖酵解)。因此，已知癌細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，在能量方面使用效率低下的糖酵解過(guò)程，以產(chǎn)生快速細(xì)胞增殖所需的氨基酸、脂質(zhì)，核酸等。由于這個(gè)原因，得知癌細(xì)胞比正常細(xì)胞需要更少的氧氣但產(chǎn)生更大量的乳酸。

5、因此，由于癌細(xì)胞中代謝異常導(dǎo)致的腫瘤微環(huán)境組成的變化、線粒體功能異常導(dǎo)致的凋亡抑制、以及炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)、以及癌細(xì)胞中異常代謝反應(yīng)在腫瘤生長(zhǎng)中起著非常重要的作用。因此，利用這些特點(diǎn)開(kāi)發(fā)代謝相關(guān)的抗癌劑可能是解決常規(guī)抗癌劑副作用和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題的好方法。

6、已知當(dāng)將存在于細(xì)胞中的線粒體分離，并在體外對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行處理，或?qū)⒕€粒體注射入體內(nèi)時(shí)，線粒體進(jìn)入細(xì)胞。通過(guò)利用這種現(xiàn)象，可以將從細(xì)胞中分離出的正常線粒體注射到體內(nèi)以治療由線粒體功能障礙引起的疾病，或具體地，以線粒體為載體將特定蛋白質(zhì)有效地遞送至細(xì)胞中來(lái)治療疾病，但是尚未有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、技術(shù)問(wèn)題

2、本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種有效的蛋白質(zhì)傳遞系統(tǒng)，顯示線粒體可以作為將表現(xiàn)出各種藥理作用的蛋白質(zhì)有效地遞送至細(xì)胞中的手段。另外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于有效遞送藥物的重組蛋白，并提供使用所述重組蛋白生產(chǎn)的修飾的線粒體。另外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包含修飾的線粒體作為活性成分的藥物組合物。

3、解決問(wèn)題的方案

4、為了解決上述問(wèn)題，提供了一種修飾的線粒體，其中外源蛋白結(jié)合至所述線粒體的外膜。此外，為了制備所述修飾的線粒體，提供了一種融合蛋白，其包含線粒體外膜錨定肽和所需的藥物蛋白。另外，提供了包含抗體或其片段和線粒體外膜錨定肽的融合蛋白。

5、發(fā)明效果

6、當(dāng)將結(jié)合有外源蛋白的線粒體施用于人體時(shí)，所述外源蛋白可被有效地遞送至細(xì)胞中。另外，細(xì)胞的受損功能可以通過(guò)遞送至細(xì)胞中的藥理活性蛋白質(zhì)來(lái)修復(fù)。此外，當(dāng)將結(jié)合有藥理活性蛋白質(zhì)的外源蛋白的線粒體遞送至細(xì)胞中時(shí)，所述藥理活性蛋白質(zhì)從細(xì)胞中的線粒體解離，并且可以預(yù)期有效的作用。另外，包含抗體片段的修飾的線粒體可被有效地遞送至靶細(xì)胞。具體地，當(dāng)靶向存在于癌組織表面上的蛋白質(zhì)的抗體的片段結(jié)合至所述線粒體的表面時(shí)，所述修飾的線粒體可被有效地遞送至癌細(xì)胞中。因此，引入修飾的線粒體不僅可以恢復(fù)受損的細(xì)胞電子傳遞系統(tǒng)，并且可以通過(guò)結(jié)合至修飾的線粒體的藥理活性蛋白質(zhì)來(lái)預(yù)防或治療各種疾病。

技術(shù)特征：

1.一種分離的修飾的線粒體，其中，外源蛋白結(jié)合至所述線粒體的外膜；

2.如權(quán)利要求1所述的分離的修飾的線粒體，其中，所述線粒體分離自真核細(xì)胞、組織或血小板。

3.如權(quán)利要求1所述的分離的修飾的線粒體，其中，所述線粒體錨定肽包含蛋白質(zhì)的n末端區(qū)域或c末端區(qū)域，所述蛋白質(zhì)存在于線粒體膜蛋白中。

4.如權(quán)利要求3所述的分離的修飾的線粒體，其特征在于，存在于所述線粒體膜蛋白中的所述蛋白質(zhì)的n末端區(qū)域或c末端區(qū)域位于所述線粒體的外膜上。

5.如權(quán)利要求3所述的分離的修飾的線粒體，其特征在于，所述線粒體錨定肽選自由tom20、tom70、om45、tom5、tom6、tom7、tom22、fis1、bcl-2、bcl-x和vamp1b構(gòu)成的組中的任何一種。

6.如權(quán)利要求3所述的分離的修飾的線粒體，其特征在于，所述線粒體錨定肽包含選自由tom20、tom70和om45構(gòu)成的組中任何一種的n末端區(qū)域。

7.如權(quán)利要求3所述的分離的修飾的線粒體，其特征在于，所述線粒體錨定肽包含選自由tom5、tom6、tom7、tom22、fis1、bcl-2、bcl-x和vamp1b構(gòu)成的組中任何一種的c末端區(qū)域。

8.如權(quán)利要求1所述的分離的修飾的線粒體，其中，所述外源蛋白為靶點(diǎn)靶向蛋白，所述靶點(diǎn)靶向蛋白結(jié)合至tom20、tom70或om45的n末端區(qū)域。

9.如權(quán)利要求1所述的分離的修飾的線粒體，其中，所述靶點(diǎn)靶向蛋白為存在于腫瘤細(xì)胞表面上的配體或受體。

10.如權(quán)利要求9所述的分離的修飾的線粒體，其中，存在于腫瘤細(xì)胞表面上的配體或受體為選自由cd19、cd20、黑色素瘤抗原e即mage、ny-eso-1、癌胚抗原即cea、黏蛋白1細(xì)胞表面相關(guān)蛋白即muc-1、前列腺酸磷酸酶即pap、前列腺特異性抗原即psa、存活蛋白、酪氨酸相關(guān)蛋白1即tyrp1、酪氨酸相關(guān)蛋白1即tyrp2、brachyury、間皮素、表皮生長(zhǎng)因子受體即egfr、人表皮生長(zhǎng)因子受體2即her-2、erbb2、wilms腫瘤蛋白即wt1、fap、epcam、pd-l1、acpp、cpt1a、ifng、cd274、folr1、epcam、icam2、ncam1、lrrc4、unc5h2?lilrb2、ceacam、連接素3或其組合構(gòu)成的組中的任何一種。

11.如權(quán)利要求1所述的分離的修飾的線粒體，其中，所述外源蛋白為靶點(diǎn)靶向蛋白，所述靶點(diǎn)靶向蛋白結(jié)合至選自由tom5、tom6、tom7、tom22、fis1、bcl-2、bcl-x和vamp1b構(gòu)成的組中任何一種的c末端區(qū)域。

12.如權(quán)利要求1所述的分離的修飾的線粒體，其特征在于，所述外源蛋白進(jìn)一步包含至少一個(gè)接頭。

13.如權(quán)利要求12所述的分離的修飾的線粒體，其中，所述接頭由1至150個(gè)氨基酸組成。

14.如權(quán)利要求12所述的分離的修飾的線粒體，其中，所述接頭由5至50個(gè)氨基酸組成，所述氨基酸為甘氨酸和絲氨酸。

15.如權(quán)利要求14所述的分離的修飾的線粒體，其中，所述接頭為(g4s)n，其中n是1至10的整數(shù)。

16.如權(quán)利要求12所述的分離的修飾的線粒體，其中，所述融合蛋白具有以下任一結(jié)構(gòu)：

17.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1所述的分離的修飾的線粒體作為活性成分。

18.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物用于預(yù)防或治療癌癥。

19.如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中，所述癌癥為選自由胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宮頸癌、甲狀腺癌、喉癌、急性髓細(xì)胞性白血病、腦瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、頭頸癌、唾液腺癌和淋巴瘤構(gòu)成的組中的任何一種。

20.如權(quán)利要求1所述的分離的修飾的線粒體作為胞內(nèi)和胞外遞送外源蛋白的手段的用途，所述外源蛋白包含靶點(diǎn)靶向蛋白，所述靶點(diǎn)靶向蛋白能夠與存在于細(xì)胞膜中的配體或受體結(jié)合，

21.一種融合蛋白，其包含具有與存在于細(xì)胞膜中的配體或受體結(jié)合的能力的靶點(diǎn)靶向蛋白和線粒體外膜錨定肽。

22.如權(quán)利要求21所述的融合蛋白，其中，所述線粒體外膜錨定肽為選自由tom20、tom70、om45、tom5、tom6、tom7、tom22、fis1、bcl-2、bcl-x和vamp1b構(gòu)成的組中的任何一種。

23.如權(quán)利要求21所述的融合蛋白，其中，所述靶點(diǎn)靶向蛋白和線粒體錨定肽從n末端至c末端結(jié)合。

24.如權(quán)利要求21所述的融合蛋白，其中，所述靶點(diǎn)靶向蛋白為抗體或其片段。

25.如權(quán)利要求24所述的融合蛋白，其中，所述抗體的片段為選自由fab、fab'、scfv和f(ab)2構(gòu)成的組中的任何一種。

26.一種多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求21所述的融合蛋白。

27.一種制備分離的修飾的線粒體的方法，包括將分離的線粒體與如權(quán)利要求21所述的融合蛋白混合的步驟。

28.一種從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中制備分離的修飾的線粒體的方法，通過(guò)將編碼如權(quán)利要求21所述的融合蛋白的多核苷酸注射到真核細(xì)胞中。

技術(shù)總結(jié)
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)靶向蛋白修飾的線粒體可以被有效地遞送至靶點(diǎn)。另外，當(dāng)結(jié)合至所述修飾的線粒體的目的蛋白被遞送到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可以表現(xiàn)出各種活性。所述修飾的線粒體可以有效地導(dǎo)致癌癥組織死亡，因此也可以用作抗癌劑。進(jìn)一步地，根據(jù)修飾的線粒體上負(fù)載的靶向蛋白表現(xiàn)出各種活性，因此修飾的線粒體可應(yīng)用于治療各種疾病。另外，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，包含所需蛋白質(zhì)的融合蛋白和包含靶向蛋白的融合蛋白可以用來(lái)修飾線粒體。而且，經(jīng)融合蛋白修飾的線粒體在靶細(xì)胞中表現(xiàn)出各種作用。

技術(shù)研發(fā)人員：韓圭范,金天炯,金有珍,柳信惠,金奈英,金美真,崔容秀,李敍溵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：白雁生物技術(shù)公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9