本發(fā)明屬于生物，涉及一種功能增強的重組纖連蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、纖連蛋白(fibronectin，fn)是一種存在于多種動物細胞外基質(zhì)和基底膜中的大分子糖蛋白，對細胞黏附起到關(guān)鍵作用，也參與細胞增殖、分化、止血和創(chuàng)傷修復(fù)等過程，在癌癥診斷、早產(chǎn)預(yù)測、動物細胞培養(yǎng)和美容護膚領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

2、纖連蛋白是一個模塊蛋白，主要由i型、ii型和iii型的重復(fù)單元組成，其單體由于存在可變剪接，分子量在230kd-270kd之間波動。進一步地，兩個單體通過c端的二硫鍵連接形成分子量達到約500kd的二聚體，通過不同的結(jié)合位點與膠原蛋白/明膠、整合素、肝素、纖連蛋白以及其它細胞外分子結(jié)合，從而發(fā)揮相應(yīng)的功能。

3、隨著合成生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，dna重組、蛋白質(zhì)從頭設(shè)計及結(jié)構(gòu)預(yù)測等技術(shù)大力推動了功能蛋白的理性設(shè)計和高效工業(yè)化生產(chǎn)。例如申請人之前的研究成果(中國專利申請cn?116574173a)公開了一種蛋白穩(wěn)定性增強的重組人源纖連蛋白突變體及其表達菌株，其在人纖連蛋白關(guān)鍵功能域fn?iii9-10的基礎(chǔ)上，對重組人源纖連蛋白中的第28位或第78位氨基酸進行突變形成蛋白穩(wěn)定性增強的重組人源纖連蛋白突變體，且重組人源纖連蛋白突變體1和突變體2相較于原始重組人源纖連蛋白，能進一步促進人成纖維細胞的細胞增殖、遷移和黏附性能。申請人在上述研究成果的基礎(chǔ)上進一步研發(fā)，獲得了本發(fā)明的功能增強的重組纖連蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種功能增強的重組纖連蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的第171位突變?yōu)楦彼岬娜死w連蛋白與整合素結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)域fn?iii8-10置于c端，以及氨基酸序列如seq?id?no.2所示的人纖連蛋白與細胞因子結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)域fn?iii12-14置于n端，進行融合表達，獲得了一種功能增強的重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10。

4、本發(fā)明所述的功能增強的重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10，其氨基酸序列如seqid?no.3所示。

5、本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，對重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10進行密碼子優(yōu)化，獲得編碼上述重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10的基因，其由如seq?id?no.4所示的第171位突變?yōu)楦彼岬娜死w連蛋白fn?iii8-10功能區(qū)的核苷酸序列，以及如seq?idno.5所示的人纖連蛋白fn?iii12-14功能區(qū)的核苷酸序列融合而成，核苷酸序列如seq?idno.6所示。

6、進一步地，本發(fā)明構(gòu)建高效表達重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10的菌株，首先分別合成第171位突變?yōu)楦彼岬娜死w連蛋白fn?iii8-10功能區(qū)以及人纖連蛋白fn?iii12-14功能區(qū)的核苷酸序列，然后分別pcr擴增并無縫克隆到ppic9k空載體中，測序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)富集和sali酶切線性化后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，通過g418抗性梯度篩選獲得高效分泌表達重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10的畢赤酵母基因工程菌。

7、更進一步地，本發(fā)明提供上述重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10的制備方法，具體為：將高效表達重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10的畢赤酵母基因工程菌接種在bmmy培養(yǎng)基中，30℃下經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達48-72小時，收集上清，純化得到重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10。

8、本發(fā)明還提供上述重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10在制備護膚品中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明在中國專利申請cn?116574173?a的重組人源纖連蛋白突變體的基礎(chǔ)上，將控制整合素和生長因子結(jié)合的人纖連蛋白fn?iii8-10和fn?iii12-14區(qū)域進行融合，同時將fn?iii8-10的第171位突變?yōu)楦彼幔@得了一種功能增強的重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10。本發(fā)明的重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10表現(xiàn)出優(yōu)于上述重組人源纖連蛋白突變體的促進細胞增殖和細胞黏附的作用，在護膚品等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.?功能增強的重組纖連蛋白，其特征在于，為重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

2.?編碼權(quán)利要求1所述的重組纖連蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq?idno.6所示。

3.?高效表達如權(quán)利要求1所述的重組纖連蛋白的菌株，其特征在于，通過以下方法構(gòu)建：首先分別合成如seq?id?no.4所示的第171位突變?yōu)楦彼岬娜死w連蛋白fn?iii8-10功能區(qū)以及如seq?id?no.5所示的人纖連蛋白fn?iii12-14功能區(qū)的核苷酸序列，然后分別pcr擴增并無縫克隆到ppic9k空載體中，測序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)富集和sali酶切線性化后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，通過g418抗性梯度篩選獲得高效表達重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10的畢赤酵母基因工程菌。

4.?如權(quán)利要求1所述的重組纖連蛋白的制備方法，其特征在于，具體為：將權(quán)利要求3所述的高效表達重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10的畢赤酵母基因工程菌接種在bmmy培養(yǎng)基中，30℃下經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達48-72小時，收集上清，純化得到重組纖連蛋白fn?iii12-14-8-10。

5.如權(quán)利要求1所述的重組纖連蛋白在制備護膚品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種功能增強的重組纖連蛋白及其制備方法和應(yīng)用。所述的重組纖連蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示，由第171位突變?yōu)楦彼岬娜死w連蛋白與整合素結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)域FN?III8?10以及人纖連蛋白與細胞因子結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)域FN?III12?14融合而成。本發(fā)明的重組纖連蛋白具有增強的促進人成纖維細胞的細胞增殖和黏附性能，表現(xiàn)出優(yōu)異的細胞生物學(xué)功效，可在畢赤酵母工程菌株中高效表達，在護膚、美容和組織工程領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：趙健烽,周潔,朱逸麗,季樂,王菊,譚成龍
受保護的技術(shù)使用者：浙江諸暨聚源生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9