本發(fā)明屬于融合抗菌肽，具體涉及一種抑制結(jié)核分枝桿菌的融合抗菌肽及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來，具有高抗菌活性，不易產(chǎn)生耐藥性和嚴重不良反應(yīng)的抗菌肽漸漸進入研究者視線?？咕?antimicrobial?peptide，amp)是生物體產(chǎn)生的一種陽離子多肽，廣泛存在于從原蟲到人類的各種生物體內(nèi)，對革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌甚至某些真菌、原生動物都有殺滅作用，有可能成為結(jié)核治療的一個新途徑。如人α-防御素(humanα-defensin,had)、人β-防御素1-2(humanβ-defensin1-2,hbd-1,hbd-2)、人中性粒細胞防御素1-3(human?neutrophil?peptides?1-3,hnp1，2，3)、組織蛋白酶抑制素ll-37(cathelicidin，ll37)、nk-lysin及豬源性抗微生物多肽pg-1、pr-39等抗菌肽對抗結(jié)核桿菌均有較好的作用，也不存在結(jié)核化療藥物的肝功能損害、胃腸道癥狀、過敏反應(yīng)等一系列不良反應(yīng)和毒副作用。

2、噬菌體作為一種細菌的病毒，可以有效地與宿主細菌相互作用。由于噬菌體能夠特異性裂解宿主菌，金黃色葡萄球菌噬菌體、銅綠假單胞菌噬菌體等多種噬菌體已用于臨床試驗。而分枝桿菌噬菌體d29因能特異性裂解結(jié)核桿菌而成為研究熱點。體外實驗顯示d29具有較好的滅菌效果，然而若要進入機體內(nèi)抗結(jié)核桿菌尤其是抗胞內(nèi)感染，由于d29進入巨噬細胞的數(shù)量少，滅菌效率并不高。因此研究者從分支桿菌噬菌體d29上找到了一個小分子多肽pk34，其可以專一地結(jié)合于結(jié)核桿菌表面最豐富的糖酯(海藻糖二霉菌酸酯，trehalose-6,6’-dimycolate，tdm)。tdm被稱作結(jié)核桿菌的核心因子，給小鼠尾靜脈注射tdm，可以全方位模擬結(jié)核桿菌感染后肺部發(fā)生的一系列的免疫病理反應(yīng)，因此tdm是研發(fā)抗結(jié)核桿菌藥物的一個重要靶標。除此之外，pk34還具有殺滅結(jié)核桿菌和抗炎能力。體內(nèi)抗結(jié)核動物模型試驗表明pk34具有與利福平相當?shù)捏w內(nèi)清除結(jié)核桿菌的能力。pk34通過抑制絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated?protein?kinase，mapk)和蛋白激酶b(protein?kinase?b，pkb)的活化，而抑制炎癥因子的大量分泌，但同時維持一定炎癥細胞因子水平以保持實驗動物正常的免疫能力。這種專一性、高效滅菌和抗炎的功能，使pk34有望成為一種靶向治療結(jié)核桿菌感染的輔助藥物，或作為研發(fā)抗結(jié)核藥物的模板。然而pk34很難通過巨噬細胞對胞內(nèi)的結(jié)核桿菌發(fā)揮作用，妨礙了pk34在抗結(jié)核治療的進程。也成為pk34等新型高效抗菌肽應(yīng)用于抗胞內(nèi)感染治療的關(guān)鍵問題。

3、組織蛋白酶抑制素ll-37(cathelicidin，ll37)是一類線性陽離子α螺旋肽類生物活性抗菌肽，由37個氨基酸構(gòu)成，是以無活性的前體hcap-18存在于人或哺乳動物的固有免疫細胞中。在人類的中性粒細胞、自然殺傷細胞和肥大細胞等細胞中持續(xù)表達，并以顆粒形式儲存在胞漿中。對于巨噬細胞，可由環(huán)境因素誘導(dǎo)表達ll-37，比如當細菌或細菌細胞壁成分接觸，組織發(fā)生感染或損傷，維生素d3增多時，巨噬細胞會被誘導(dǎo)表達hcap-18。另外，有研究表明在巨噬細胞中外源性增加或內(nèi)源性的過量表達ll-37或hcap18可提高胞內(nèi)殺滅分枝桿菌效率。其抗菌機制為：ll-37的陽離子螺旋二級結(jié)構(gòu)使其帶有正電荷，能通過電荷吸引結(jié)合到帶有負電荷的細菌細胞膜表面。隨后ll-37穿過細胞外層膜到達內(nèi)層菌膜引起細菌胞膜的破壞導(dǎo)致細菌死亡。由于真核細胞膜表面是中性的，并且含有能降低ll-37與膜相互作用的膽固醇，這些特征抑制了ll-37與真核細胞(包括原蟲、真菌、植物和動物細胞等)的作用。

4、抗菌肽其在體內(nèi)進入巨噬細胞的發(fā)揮抗胞內(nèi)感染的功效亦難掌控，比如ll-37通過巨噬細胞的主動的胞飲作用或抗菌肽的滲透作用進入細胞發(fā)揮作用。若是胞內(nèi)感染，由于巨噬細胞的主動攝取或抗菌肽滲透作用，感染所在部位抗菌肽的濃度的影響，以及自身表達抗菌肽等的功能，會受到細胞自身狀態(tài)的影響，在很多時候抗菌肽無法在胞內(nèi)達到抑菌或滅菌的濃度。還有的抗菌肽需要進入到細菌內(nèi)，作用于菌體dna或其他胞漿中的靶細胞器，殺滅細菌，如pr39。那么達到炎癥的中心或進入巨噬細胞還不是最后一步，抗菌肽還需要通過結(jié)核桿菌的細胞壁和三層生物膜才能進入菌體，與特定的靶細胞器相互作用導(dǎo)致細菌死亡。我們?nèi)绾伟邢蛐缘脑诰奘杉毎麅?nèi)最大化的發(fā)揮功能成為我們要解決的關(guān)鍵問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)ll-37不僅具有廣譜的抗菌活性，殺菌快速，而且能夠影響炎癥因子的表達，在機體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。pk34作為從結(jié)核分枝桿菌噬菌體中分離出來的一段小分子多肽，能夠?qū)Ｒ坏亟Y(jié)合結(jié)核分枝桿菌表面最豐富的糖酯，對mtb的殺滅作用與利福平不相上下。但當二者單獨作用時，ll-37殺菌的專一性不如pk34，pk34的免疫調(diào)節(jié)作用不如ll-37的問題，本發(fā)明提供一種抑制結(jié)核分枝桿菌的融合抗菌肽及制備方法和應(yīng)用，不僅克服了抗菌藥物不易到達靶點的缺點，還能避免單一抗菌肽的不穩(wěn)定性，降低成本和毒副作用。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種抑制結(jié)核分枝桿菌的融合抗菌肽，其特征是：所述融合抗菌肽由pk34和ll-37組成，其氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

3、抑制結(jié)核分枝桿菌的融合抗菌肽的制備方法，所述融合抗菌肽由固相合成法合成，合成步驟包括，

4、(1)將2-chlorotrityl?chloride?resin放入反應(yīng)管中，加dmf，振蕩60min，進行樹脂溶漲，通過沙芯抽濾掉溶劑，加入過量的fmoc保護c端第一個氨基酸，再加入過量的diea，最后加入dmf溶解，振蕩30min，使用甲醇封頭30min，接入第一個氨基酸；

5、(2)去除dmf，加20％哌啶dmf溶液，5min后去除，再加20％哌啶dmf溶液，15min，實現(xiàn)脫保護；依次使用dmf、甲醇、dmf各洗滌兩次；加入fmoc保護氨基酸，再加入hbtu、diea和dmf，振蕩45min；依次使用dmf洗滌一次，甲醇洗滌兩次，dmf洗滌兩次；

6、(3)重復(fù)(2)操作，從右到左依次連接序列seq?id?no:1中的氨基酸，直到去除最后一個氨基酸的fmoc保護基，依次使用兩次dmf、三次dcm、四次甲醇洗滌樹脂，抽干10min；

7、(4)使用tfa；水；edt；tis配制切割液，切割180min，將裂解液用氮氣盡量吹干，乙醚析出，離心去除上清，沉淀用乙醚洗六次，然后常溫揮干；

8、(5)取少許粗品，h2o/acn溶解，在hplc分析儀器上進行分析判斷目標峰對應(yīng)出峰時間，收集目標峰溶液，將合格的目標峰溶液進行凍干，得到融合抗菌肽。

9、進一步的，所述(1)的具體步驟包括，

10、將2-chlorotrityl?chloride?resin放入反應(yīng)管中，加15ml/g的mf，振蕩60min，進行樹脂溶漲，通過沙芯抽濾掉溶劑，加入3倍摩爾過量的fmoc保護c端第一個氨基酸，再加入10倍摩爾過量的diea，最后加入dmf溶解，振蕩30min，使用甲醇封頭30min，接入第一個氨基酸。

11、進一步的，所述(2)的具體步驟包括，

12、去除dmf，加20％哌啶dmf溶液，濃度為15ml/g，5min后去除，再加20％哌啶dmf溶液，濃度為15ml/g，15min，實現(xiàn)脫保護；依次使用10ml/g的dmf、甲醇、dmf各洗滌兩次；加入3倍摩爾過量fmoc保護氨基酸，再加入3倍摩爾過量hbtu、10倍摩爾過量diea，再加入dmf溶解，振蕩45min；依次使用10ml/g的dmf洗滌一次，10ml/g的甲醇洗滌兩次，10ml/g的dmf洗滌兩次。

13、進一步的，所述(3)的具體步驟包括，

14、重復(fù)(2)操作，從右到左依次連接序列seq?id?no:1中的氨基酸，直到去除最后一個氨基酸的fmoc保護基，依次使用兩次10ml/g的dmf、三次10ml/g的dcm、四次10ml/g的甲醇洗滌樹脂，抽干10min。

15、進一步的，所述(4)的具體步驟包括，

16、按體積百分數(shù)為tfa?95％；水2％；edt?2％；tis1％配制切割液，切割180min，將裂解液用氮氣盡量吹干，乙醚析出，離心去除上清，沉淀用乙醚洗六次，然后常溫揮干。

17、進一步的，所述(5)的具體步驟包括，

18、取少許粗品，h2o/acn溶解，在hplc分析儀器上進行分析判斷目標峰對應(yīng)出峰時間，利用c18反相色譜制備系統(tǒng)：wavelength:220nm；flow?rate:15ml/min；inj.vol:20mlcolumn?temp:25℃；buffer?a:0.1％?tfa?in?water?buffer?b:0.1％tfa?inacetonitrile；收集目標峰溶液，將合格的目標峰溶液進行凍干，得到融合抗菌肽。

19、抑制結(jié)核分枝桿菌的融合抗菌肽的應(yīng)用，所述融合抗菌肽通過上述的方法制備，所述融合抗菌肽用于非治療性的胞內(nèi)或胞外殺滅結(jié)核分枝桿菌。

20、抑制結(jié)核分枝桿菌的融合抗菌肽的應(yīng)用，所述融合抗菌肽通過上述的方法制備，所述融合抗菌肽用于非治療性的胞外促進巨噬細胞或a549細胞的增殖，或促進巨噬細胞中il-2與il-10的表達，抑制炎性因子tnf-α和ip-10的表達。

21、抑制結(jié)核分枝桿菌的融合抗菌肽的應(yīng)用，所述融合抗菌肽通過上述的方法制備，所述融合抗菌肽用于非治療性的胞內(nèi)抑制tnf-αmrna、il-6mrna的表達。

22、本發(fā)明的有益之處：

23、本發(fā)明具備兩種多肽的優(yōu)勢，能夠?qū)Ｒ坏慕Y(jié)合于結(jié)核桿菌表面，達到靶向殺滅巨噬細胞內(nèi)潛伏結(jié)核分枝桿菌的效果，通過抗菌肽ll-37的抗菌尤其是結(jié)核分枝桿菌、抗炎及促組織修復(fù)優(yōu)勢，以及pk34的能夠?qū)Ｒ恍宰R別結(jié)核桿菌表面糖脂和高效殺滅結(jié)核桿菌，這兩個方面的特點，使融合抗菌肽ll-37/pk34，專一性結(jié)合胞內(nèi)分枝桿菌，達到高效靶向殺滅胞內(nèi)結(jié)核桿菌的目的，不僅克服了抗菌藥物不易到達靶點的缺點，還能避免單一抗菌肽的不穩(wěn)定性，降低成本和毒副作用。