本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及三個(gè)具有交叉保護(hù)作用的豬鏈球菌抗原蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬鏈球菌是一種重要人畜共患病的病原菌，該菌感染豬可引起腦膜炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥等多種疾病，感染率和致死率均較高，是危害養(yǎng)豬業(yè)和公共衛(wèi)生健康的病原細(xì)菌之一。

2、豬鏈球菌病的防控主要依賴于抗菌藥物和疫苗，但隨著豬鏈球菌耐藥性形勢(shì)逐漸嚴(yán)峻，疫苗成為防控該病最經(jīng)濟(jì)有效的手段。雖然目前已有豬鏈球菌病的商品化疫苗，但由于豬鏈球菌血清型眾多、變異速度快，且引起的疾病種類多，因此開(kāi)發(fā)高效、安全的疫苗具有重要意義。亞單位疫苗因其安全性高、能夠提供交叉免疫保護(hù)效果道優(yōu)點(diǎn)，成為具有前景的一類疫苗。然而，由于豬鏈球菌菌株較高的多樣性，開(kāi)發(fā)具有良好交叉免疫保護(hù)效果的亞單位疫苗仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。

3、反向疫苗學(xué)是以病原體微生物的基因組序列為基礎(chǔ)，利用氨基酸或核苷酸序列分析工具，對(duì)病原體的基因組進(jìn)行篩選，選擇能表達(dá)符合條件的候選抗原的基因，隨后對(duì)篩選得到的抗原蛋白進(jìn)行表達(dá)與純化，再對(duì)純化后的抗原蛋白保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，保護(hù)效果較好的抗原可用于下一步的疫苗設(shè)計(jì)。目前，公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)有數(shù)千個(gè)豬鏈球菌的全基因組序列，為疫苗候選抗原蛋白的篩選提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于篩選一種新的且具有交叉保護(hù)效果的豬鏈球菌疫苗抗原蛋白，隨后對(duì)篩選得到的候選抗原進(jìn)行保護(hù)效果評(píng)估。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下：

3、以944株病豬來(lái)源的豬鏈球菌菌株的全基因組序列為基礎(chǔ)，使用prokka和panaroo等軟件構(gòu)建了豬鏈球菌泛基因組，將在99％的豬鏈球菌菌株中均存在的基因歸為核心基因組。進(jìn)一步使用psortb、tmhmm、blast、vaxijen等生物信息學(xué)工具對(duì)這些基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析、與宿主蛋白的同源性分析及其免疫原性的預(yù)測(cè)和分析，篩選定位于豬鏈球菌表面且與宿主非同源的高免疫原性蛋白質(zhì)。

4、以豬鏈球菌sc19菌株基因組為模板，pet-28a質(zhì)粒為載體，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒。添加終濃度為0.5mm的iptg，以16℃誘導(dǎo)14h的條件進(jìn)行試表達(dá)，選擇其中的可溶性蛋白，分別使用從感染豬鏈球菌2型及9型菌株的仔豬中采集的康復(fù)血清與其進(jìn)行westernblot試驗(yàn)，檢測(cè)其反應(yīng)原性，發(fā)現(xiàn)抗原蛋白1、抗原蛋白2、抗原蛋白3均可以與2型和9型陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，表明其具有良好的反應(yīng)原性。

5、利用ni-nta親和層析純化了抗原蛋白1(seq?id?no.1)、抗原蛋白2(seq?idno.2)、抗原蛋白3(seq?id?no.3)三個(gè)蛋白。將spf級(jí)5周齡雌性km小鼠分成五組，第一組為陰性對(duì)照組(注射pbs組)，第二組免疫抗原蛋白1，第三組免疫抗原蛋白2，第四組免疫抗原蛋白3，第五組免疫商品化豬鏈球菌亞單位疫苗。免疫后對(duì)各組小鼠分別攻毒豬鏈球菌2型和9型菌株。結(jié)果顯示，在使用致死劑量的2型菌株攻毒后，未免疫的陰性對(duì)照組小鼠存活率為55％，而抗原蛋白1免疫組、抗原蛋白2免疫組、抗原蛋白3免疫組和商品化疫苗組的存活率分別為100％、88％、87％和100％。在致死劑量的9型菌株感染后，未免疫的陰性對(duì)照組小鼠存活率為33％，而抗原蛋白1免疫組、抗原蛋白2免疫組、抗原蛋白3免疫組和商品化疫苗組小鼠的存活率分別為55％、88％、62％和75％。定植實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，商品化疫苗免疫組以及抗原蛋白1免疫組、抗原蛋白2免疫組、抗原蛋白3免疫組小鼠的組織載菌量均低于陰性對(duì)照組，證明本研究篩選得到的候選抗原均能提供一定的免疫保護(hù)效果。

6、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于，

7、1、本發(fā)明篩選候選抗原的方法包括以下步驟，首先以大量病豬來(lái)源的豬鏈球菌菌株的全基因組序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建豬鏈球菌泛基因組并選取核心基因組；進(jìn)一步對(duì)核心基因進(jìn)行反向疫苗學(xué)分析，包括亞細(xì)胞定位分析，選出定位于豬鏈球菌細(xì)胞壁及細(xì)胞外的蛋白作為分泌蛋白；再使用跨膜結(jié)構(gòu)拓?fù)浞治鰜?lái)提高篩選的準(zhǔn)確性和可靠性；然后進(jìn)行與宿主蛋白的同源性分析及其免疫原性的預(yù)測(cè)和分析，選出per?identity＜35％的非同源蛋白。

8、2、按照本發(fā)明提出的篩選方法，能夠得到定位于豬鏈球菌表面且與宿主非同源的高免疫原性蛋白質(zhì)，且該候選抗原蛋白能夠具有良好交叉免疫保護(hù)效果，能夠?qū)Χ鄠€(gè)豬鏈球菌血清型提供一定的免疫保護(hù)，使得豬鏈球菌2型和9型菌株在攻毒感染后的小鼠各組織中載菌量明顯降低。

技術(shù)特征：

1.一種豬鏈球菌抗原蛋白，其特征在于，所述抗原蛋白包括抗原蛋白1、抗原蛋白2、抗原蛋白3，抗原蛋白1含有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列，抗原蛋白2含有如seq?id?no.2所示的氨基酸序列，抗原蛋白3含有如seq?id?no.3所示的氨基酸序列。

2.一種豬鏈球菌亞單位疫苗，其特征在于，所訴亞單位疫苗包括權(quán)利要求1所述的抗原蛋白1、抗原蛋白2、抗原蛋白3中的一種或多種。

3.一種權(quán)利要求1所述的抗原或權(quán)利要求2所述疫苗在豬鏈球菌診斷中的應(yīng)用，其特征在于，所述抗原或疫苗的免疫劑量為0.25mg/ml。

4.一種篩選豬鏈球菌抗原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬鏈球菌抗原蛋白及其篩選方法及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)反向疫苗學(xué)與比較基因組學(xué)分析，篩選出符合保守性、表面定位、免疫原性的抗原，并評(píng)估其與不同豬鏈球菌血清型的康復(fù)血清之間的反應(yīng)性，最終篩選出3種抗原。將3個(gè)抗原蛋白分別免疫小鼠，并用豬鏈球菌進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)抗原蛋白對(duì)于豬鏈球菌2型菌株和豬鏈球菌9型菌株的感染均能夠提供一定的保護(hù)效果。本發(fā)明公開(kāi)的抗原蛋白將在豬鏈球菌新型亞單位疫苗研究及豬鏈球菌感染診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：黃琦,周銳,曾靜子,張?jiān)伹?br/>受保護(hù)的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2