本發(fā)明涉及一種脂肪酶催化合成吡咯-2-甲酸乙酯的方法，屬于酶催化化學(xué)反應(yīng)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、吡咯-2-羧酸乙酯用作色譜分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也用于有機(jī)合成及制藥工業(yè)，主要用作聚酯纖維紡絲用溶劑。吡咯-chemicalbook2-羧酸乙酯也常用作金屬防腐劑、環(huán)氧樹(shù)脂固化劑、烯烴聚合時(shí)的催化劑以及醫(yī)藥工業(yè)的原料等，還用作光敏劑。

2、吡咯-2-羧酸乙酯的現(xiàn)有的制備方法：denis?m.bailey等人在300毫升無(wú)水乙醇中加入1.0克鈉，鈉溶解后，在10分鐘內(nèi)分批加入75克2-吡咯基三氯甲基酮，攪拌反應(yīng)30分鐘，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至干，油性殘留物經(jīng)萃取、洗滌、干燥、減壓蒸餾得到44.0～44.5克吡咯-2-羧酸乙酯(org.synth.1971,51,100)；中國(guó)專利cn108299270a中公開(kāi)的是將2-甲酸基吡咯溶解于甲醇和四氯甲烷中，加入氯化鈷，150℃回流反應(yīng)2小時(shí)，乙酸乙酯重結(jié)晶后得到2,5-吡咯二甲酸二甲酯；李紫凡等人(分析化學(xué),2008,36(7):5)將乙醇鈉2.0g溶于15ml乙醇中，再滴入溶有4.0g?2-吡咯基三氯甲基酮的20ml乙醇溶液，攪勻，回流12h，經(jīng)減壓蒸餾、重結(jié)晶后得到2,5-吡咯二甲酸二甲酯1.8g，產(chǎn)率69％。張學(xué)輝等人(解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)1(2013):3.)在60ml無(wú)水1,2-二氯乙烷、40ml無(wú)水硝基甲烷、6.7g(0.1mmol)新蒸吡咯和0.1mmol氯甲酸乙酯，在攪拌條件下，分批加入13.3g(0.1mmo1)alcl3粉末，控制反應(yīng)體系的溫度和劇烈程度，加料完畢后，冷卻反應(yīng)混合物，經(jīng)洗滌、干燥、真空蒸餾后得到吡咯-2-甲酸酯，產(chǎn)率為66.3％。

3、現(xiàn)有化學(xué)法合成吡咯-2-甲酸乙酯往往存在需要保護(hù)和去保護(hù)步驟(比如使用2-吡咯基三氯甲基酮為原料)或者反應(yīng)條件劇烈(如使用alcl3粉末做催化劑)等復(fù)雜工序和不綠色問(wèn)題，并且產(chǎn)率也低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、[技術(shù)問(wèn)題]

2、現(xiàn)有技術(shù)中吡咯-2-甲酸酯的制備存在工藝復(fù)雜，如需要保護(hù)和去保護(hù)步驟(比如使用2-吡咯基三氯甲基酮為原料)，反應(yīng)條件劇烈(如使用alcl3粉末做催化劑)，存在不安全，不環(huán)保，且產(chǎn)率低等問(wèn)題。

3、[技術(shù)方案]

4、針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供了一種脂肪酶催化合成吡咯-2-甲酸乙酯的方法，該方法是利用ps-hmdp微球作為載體來(lái)負(fù)載脂肪酶作為催化劑合成吡咯-2-甲酸乙酯，條件溫和，環(huán)境友好，并且有效的提高了吡咯-2-甲酸乙酯合成產(chǎn)率。

5、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采用的技術(shù)方案如下：

6、一種脂肪酶催化合成吡咯-2-甲酸乙酯的方法，所述方法包括如下步驟：

7、(1)ps-hmdp微球的制備

8、將氯化聚苯乙烯微球加入甲苯中溶脹，然后再加入k2co3、四丁基氯化銨和聚乙二醇反應(yīng)，得到ps-peg微球；將ps-peg微球再加入甲苯中，緩慢滴加三溴化磷反應(yīng)，得到ps-peg-br微球；之后將ps-peg-br微球加入到丁-2-酮中，加入對(duì)羥基苯甲醛和k2co3反應(yīng)，得到ps-phba微球；再將ps-phba微球加入甲醇中，分別加入尿素和濃鹽酸進(jìn)行反應(yīng)，得到ps-hmd微球；最后將ps-hmd微球加入甲苯中，加入環(huán)氧氯丙烷和naoh反應(yīng)，得到ps-hmdp微球；

9、(2)脂肪酶催化劑的制備

10、在含脂肪酶的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中加入步驟(1)制備的ps-hmdp微球，震蕩反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，洗滌，過(guò)濾，得到脂肪酶催化劑；

11、(3)吡咯-2-甲酸乙酯的制備

12、在二甲亞砜中加入步驟(2)制備的脂肪酶催化劑，吡咯-2-甲酸和乙醇，在25～45℃條件下連續(xù)振蕩9～24h，反應(yīng)結(jié)束后，離心，取上清液，用氣相色譜法測(cè)定吡咯-2-甲酸乙酯的含量；將上清液蒸餾，蒸至100℃，將殘留液倒入分液漏斗，用飽和na2co3溶液洗滌至中性，分出水層，再用飽和nacl溶液洗滌，有機(jī)層置于無(wú)水硫酸鎂的干燥瓶中干燥，將干燥后的產(chǎn)物進(jìn)行減壓蒸餾，收集108-128℃(2mmhg)的餾分，即得吡咯-2-甲酸乙酯。

13、在一種實(shí)施方式中，步驟(3)所述用氣相色譜法測(cè)定的條件：在nexis?gc-2030型氣相色譜儀上測(cè)定酯合成產(chǎn)物的含量；設(shè)備包括火焰離子化檢測(cè)器(fid)和slb-5ms毛細(xì)管柱(30m×0.25mm?id×0.25μm?df，merck?life?science)，以氮?dú)庾鳛檩d氣(20ml/min)，檢測(cè)器溫度為300℃，進(jìn)樣體積1μl；檢測(cè)吡咯-2-甲酸乙酯的溫控程序?yàn)椋?00℃(5分鐘)，然后以5℃/分鐘升溫至230℃，維持10分鐘，然后以5℃/分鐘升溫至290℃，維持5分鐘。

14、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)所述ps-peg微球的制備過(guò)程具體為：稱取6.0～20g氯化聚苯乙烯微球，加入50～200ml甲苯溶脹12～24h，再加入5.0～20g的k2co3和0.5～2g的四丁基氯化銨，根據(jù)氯化聚苯乙烯微球表面氯基含量與聚乙二醇羥基含量的摩爾比加入聚乙二醇，升溫至60～130℃，攪拌反應(yīng)12～24h后，過(guò)濾收集微球，分別用去離子水、乙醇洗滌，得到ps-peg微球。

15、在一種實(shí)施方式中，所述氯化聚苯乙烯微球使用前先依次使用10～15倍體積的丙酮、無(wú)水乙醇震蕩洗滌30min，然后在40～80℃下進(jìn)行真空烘干。

16、在一種實(shí)施方式中，所述氯化聚苯乙烯微球表面氯基含量與聚乙二醇羥基含量的摩爾比為1:6～1:12。

17、在一種實(shí)施方式中，所述聚乙二醇的平均分子量為300～2000；優(yōu)選為550。

18、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)所述ps-peg-br微球的制備過(guò)程具體為：在60～200ml甲苯中加入4.0～20g?ps-peg微球，在50～100℃下，緩慢滴加0.8～2.0ml三溴化磷，滴加結(jié)束后升溫至80～100℃，反應(yīng)5～10h，反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾，收集微球，分別用去離子水、乙醇洗滌，得到ps-peg-br微球。

19、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)所述ps-phba微球的制備過(guò)程具體為：將3.3～15gps-peg-br微球，加入30～150ml丁-2-酮，再加入0.015～0.06mol的對(duì)羥基苯甲醛和0.0025～0.01mol?k2co3，在60～100℃下磁力攪拌，回流6-12h，反應(yīng)結(jié)束后，依次使用無(wú)水乙醇、去離子水和丙酮各洗滌三次，得到ps-phba微球。

20、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)所述ps-hmd微球的制備過(guò)程具體為：將3.8～15g?ps-phba微球加入30～150ml甲醇中，再加入0.03～0.15mol尿素和10～40μl濃鹽酸進(jìn)行反應(yīng)，在常溫下磁力攪拌12～16h，反應(yīng)結(jié)束后，依次使用無(wú)水乙醇、去離子水和丙酮各洗滌三次，得到ps-hmd微球。

21、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)所述ps-hmdp微球的制備過(guò)程具體為：將3.7～15gps-hmd加入30～150ml甲苯中，再加入0.03～0.3mol環(huán)氧氯丙烷，在常溫下磁力攪拌24～48h后，加入0.05～0.2mol?naoh，反應(yīng)3～8h，反應(yīng)結(jié)束后，依次使用無(wú)水乙醇、去離子水和丙酮各洗滌三次，得到ps-hmdp微球。

22、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)所述脂肪酶的濃度為5～10mg/ml。

23、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液濃度為0.2～0.5moi/l，ph＝6.5～9.0。

24、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)所述含脂肪酶的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與ps-hmdp微球的體積質(zhì)量比為30～100：0.5～1.5；ml/g。

25、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)所述震蕩反應(yīng)條件：在25～60℃、800～1500rpm的條件下震蕩反應(yīng)6～12h。

26、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)所述洗滌是采用空白的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行的洗滌。

27、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)所述脂肪酶為假絲酵母candida?rugosa脂肪酶(產(chǎn)品型號(hào)013435157)、黑曲霉aspergillus?niger脂肪酶(產(chǎn)品型號(hào)011480691)、嗜熱絲孢菌thermomyces?lanuginosus脂肪酶(產(chǎn)品型號(hào)013435159)、南極假絲酵母candidaantarctica脂肪酶(產(chǎn)品型號(hào)011480689)中的任一種。

28、在一種實(shí)施方式中，步驟(3)所述脂肪酶催化劑與吡咯-2-甲酸和乙醇比例為：1.5～2：0.3～4：1.5～3；g:mmol:mmol。

29、在一種實(shí)施方式中，步驟(3)所述二甲亞砜(dmso)和脂肪酶催化劑的比例為：30～100：1.5～2；ml/g。

30、在一種實(shí)施方式中，所述吡咯-2-甲酸乙酯產(chǎn)率為80～85％。

31、本發(fā)明還提供了一種由上述所述的脂肪酶催化合成吡咯-2-甲酸乙酯的方法在吡咯-2-甲酸乙酯生產(chǎn)監(jiān)控、質(zhì)檢中的應(yīng)用。

32、有益效果：

33、本發(fā)明利用ps-hmdp微球作為載體來(lái)負(fù)載脂肪酶作為催化劑合成吡咯-2-甲酸乙酯，條件溫和，毒副作用少，環(huán)境友好，避免了保護(hù)和去保護(hù)復(fù)雜工藝的使用；并且有效的提高了吡咯-2-甲酸乙酯合成產(chǎn)率，產(chǎn)率達(dá)到80～85％。