本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種交聯(lián)的碳酸酐酶及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、碳酸酐酶(ca)是一種鋅金屬酶，它催化二氧化碳和碳酸氫鹽的可逆水合和脫水，在許多生理和病理過程中起關(guān)鍵作用的反應(yīng)。碳酸酐酶抑制劑(cai)被用于治療青光眼、視網(wǎng)膜病變、心源性水腫和急性高原病等各種疾病。但是，目前臨床上使用cai(乙酰唑胺、布林酰胺、多佐胺等)沒有選擇性，容易導(dǎo)致不良的副作用。因此cai的篩選與開發(fā)具有重要意義。

2、中藥中含有豐富的活性成分，是cai篩選和開發(fā)的重要資源，傳統(tǒng)中藥活性成分的發(fā)現(xiàn)是以活性篩選模型為基礎(chǔ)的，主要以細(xì)胞、動物為主，這種方法雖然有效，然而存在需要較長的造模時間和較高的成本等問題。

3、近年來，集分離與分析為一體的“配體垂釣”法被廣泛應(yīng)用于中藥藥效物質(zhì)篩選。配體垂釣是基于分子間的親和作用辨識相互作用的配體與受體，然后通過與現(xiàn)代分析手段相結(jié)合，用以篩選并確定與蛋白結(jié)合的生物活性分子的一種方法。常見的配體垂釣方法有親和超濾法、親和磁性法、細(xì)胞膜色譜法、生物反應(yīng)器法等。上述配體垂釣方法需要采用載體將酶進行固定化，所用到的載體例如磁納米顆粒、碳納米管、中空纖維等，例如公開號為cn104404024b的中國專利公開了一種固定化碳酸酐酶及其制備方法，該固定化碳酸酐酶包括磁性納米顆粒、富醛基復(fù)合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，所述富醛基殼的表面醛基與碳酸酐酶通過共價鍵結(jié)合。這些載體雖然有助于酶的分離和再利用，然而，引入該類無活性的載體往往會導(dǎo)致較高的成本、酶活性的下降以及額外的物理、化學(xué)修飾步驟。

4、通過形成酶聚集體，使用交聯(lián)劑在酶聚集體之間達到固定化的無載體固定化技術(shù)由于具有成本低、酶活性高的優(yōu)點有望成為替代載體固定化技術(shù)以實現(xiàn)配體垂釣，但是在酶聚集體的制備過程中如何保持酶的活性和酶聚集體的穩(wěn)定性是技術(shù)難點，同時交聯(lián)的碳酸酐酶以及基于交聯(lián)的碳酸酐酶用于篩選和開發(fā)cai在現(xiàn)有技術(shù)中還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中載體固定化酶技術(shù)存在成本高，步驟繁瑣問題以及酶聚集體的制備過程中酶活性易下降，酶聚集體不穩(wěn)定問題，提供一種交聯(lián)的碳酸酐酶及其制備方法和應(yīng)用，經(jīng)過實驗驗證，本發(fā)明交聯(lián)的碳酸酐酶能夠應(yīng)用于碳酸酐酶抑制劑的篩選和開發(fā)，并且快速、準(zhǔn)確的捕獲中藥活性成分，大大縮短了中藥藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的周期，同時成本低，降低了配體垂釣方法的使用門檻。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明第一方面提供了一種交聯(lián)的碳酸酐酶的制備方法，包括以下步驟：

4、s1、將碳酸酐酶溶液和沉淀劑混合，進行沉淀反應(yīng)，得第一混合液；所述沉淀劑為乙醇或乙腈；

5、s2、向第一混合液中加入交聯(lián)劑混合，進行交聯(lián)反應(yīng)，得第二混合液；

6、s3、將第二混合液得沉淀物，即為交聯(lián)的碳酸酐酶。

7、優(yōu)選地，步驟s1中所述碳酸酐酶溶液的制備方法為：將碳酸酐酶溶于緩沖液中，所述碳酸酐酶溶液濃度為0.1-10mg/ml，優(yōu)選為1mg/ml。

8、優(yōu)選地，步驟s1中所述碳酸酐酶溶液和沉淀劑的體積比為1-1000μl：90-9000μl。

9、優(yōu)選地，步驟s1中所述碳酸酐酶溶液和沉淀劑的體積比為100μl：900μl。

10、優(yōu)選地，步驟s1中所述沉淀劑為乙醇。

11、優(yōu)選地，步驟s1中所述沉淀反應(yīng)的條件：溫度為2-10℃，時間為0.5-10h。

12、優(yōu)選地，步驟s1中所述沉淀反應(yīng)的條件：溫度為6℃，時間為2h。

13、優(yōu)選地，步驟s2中所述交聯(lián)劑為戊二醛，所述戊二醛的終濃度為1-6nm。

14、優(yōu)選地，步驟s2中所述戊二醛的終濃度為2-4nm。

15、優(yōu)選地，步驟s2中所述交聯(lián)反應(yīng)的條件：溫度為5-45℃，時間為1-3h。

16、優(yōu)選地，步驟s2中所述交聯(lián)反應(yīng)的條件：溫度為20-30℃，時間為2-2.5h。

17、優(yōu)選地，步驟s2中所述交聯(lián)反應(yīng)的條件：溫度為25℃，時間為2.5h。

18、優(yōu)選地，步驟s3中所述離心的條件：離心力為1000-14000×g，時間為5-

19、30min。

20、優(yōu)選地，步驟s3中所述離心的條件：離心力為12000×g，時間為10min。

21、優(yōu)選地，步驟s3中還包括采用緩沖液沖洗沉淀物，沖洗次數(shù)為1-3次。

22、優(yōu)選地，所述緩沖液為3-嗎啉丙磺酸(mops)。

23、本發(fā)明第二方面提供了一種由上述制備方法得到的交聯(lián)的碳酸酐酶。

24、本發(fā)明第三方面提供了一種由上述制備方法得到的交聯(lián)的碳酸酐酶在碳酸酐酶抑制劑篩選中的應(yīng)用。

25、優(yōu)選地，所述應(yīng)用為從中藥提取物中篩選碳酸酐酶抑制劑，所述中藥提取物為丹參酚酸。

26、本發(fā)明第四方面提供了一種從丹參酚酸中篩選碳酸酐酶抑制劑的方法，包括以下步驟：

27、步驟1、制備樣品洗脫液：

28、步驟1.1、將上述制備方法得到的0.1mg的交聯(lián)的碳酸酐酶與丹參酚酸溶液混合、孵育，得孵育液；

29、步驟1.2、將孵育液進行離心得沉淀物，對沉淀物進行沖洗，得沖洗后的沉淀；

30、步驟1.3、向沖洗后的沉淀加入解吸附液進行解吸附、振蕩、離心，收集上清液為樣品洗脫液；

31、步驟2、制備陰性對照組洗脫液：

32、步驟2.1、將0.1mg的交聯(lián)的碳酸酐酶置于油浴鍋中加熱使其失活，將失活的交聯(lián)的碳酸酐酶與丹參酚酸溶液混合、孵育，得陰性對照組孵育液；

33、步驟2.2、陰性對照組孵育液重復(fù)步驟1.2和1.3，收集上清液為陰性對照組洗脫液；

34、步驟3、結(jié)構(gòu)鑒定：

35、步驟3.1、將樣品洗脫液和陰性對照組洗脫液分別進行hplc-ms分析，比較所得兩組樣品的總離子流圖中各峰的峰面積；

36、步驟3.2、若步驟3.1中峰面積差距大于10％，則進一步比較其中一級質(zhì)譜圖中所示質(zhì)荷比相對應(yīng)的提取離子圖的峰面積；

37、步驟3.3、若步驟3.2中峰面積差距大于10％，則進一步進行uplc-qtof分析確認(rèn)結(jié)構(gòu)。

38、優(yōu)選地，所述丹參酚酸的制備方法為：將丹參粉碎后，加入80％乙醇溶脹、滲漉、過濾收集丹參提取液；丹參提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇后，加入鹽酸調(diào)節(jié)ph至3.0，靜置過夜，過濾除去濾渣，濾液上樣于d101大孔吸附樹脂，先后使用7個柱體積的純水和30％乙醇除雜，使用6個柱體積的50％乙醇洗脫，收集洗脫液，旋蒸濃縮、凍干后得到所述丹參酚酸。

39、優(yōu)選地，步驟1.1和步驟2.1中所述丹參酚酸溶液為丹參酚酸的mops溶液。

40、優(yōu)選地，步驟1.1中所述丹參酚酸溶液的體積為0.1-10ml，步驟2.1中所述丹參酚酸溶液的體積為0.1-10ml。

41、優(yōu)選地，步驟1.1中所述丹參酚酸溶液的體積為1ml，步驟2.1中所述丹參酚酸溶液的體積為1ml。

42、優(yōu)選地，步驟1.1中所述丹參酚酸溶液的濃度為0.5-20mg/ml，步驟2.1中所述丹參酚酸溶液的濃度為0.5-10mg/ml。

43、優(yōu)選地，步驟1.1中所述丹參酚酸溶液的濃度為10mg/ml，步驟2.1中所述丹參酚酸溶液的濃度為10mg/ml。

44、優(yōu)選地，步驟1.1和步驟2.1中所述孵育條件：孵育溫度為15-45℃，孵育時間為0.5-5h。

45、優(yōu)選地，步驟1.1和步驟2.1中所述孵育條件：孵育溫度為40℃，孵育時間為1h。

46、優(yōu)選地，步驟1.2中采用緩沖液對沉淀物進行沖洗，沖洗次數(shù)為1-3次。

47、優(yōu)選地，步驟1.3中所述解吸附液為甲醇，解吸附液體積為50-5000μl，優(yōu)選為400μl。

48、優(yōu)選地，步驟1.3中所述解吸附的時間為0.5-5h，優(yōu)選為1h。

49、優(yōu)選地，步驟1.3中所述離心的時間為5-30min。

50、優(yōu)選地，步驟2.1中所述加熱條件：加熱溫度為90-150℃，加熱時間為0.5-5h。

51、優(yōu)選地，步驟2.1中所述加熱條件：加熱溫度為120℃，加熱時間為2h。

52、優(yōu)選地，步驟3.1中所述hplc-ms的條件：

53、色譜條件：

54、色譜柱：acquity?uplc?hss?t3色譜柱(2.1×100mm,1.8μm)；

55、流動相：流動相a為0.05-0.15％甲酸水溶液，流動相b為乙腈；

56、洗脫方式：梯度洗脫，所述梯度洗脫過程設(shè)置如下表1：

57、表1

58、 時間(min) 流動相a(％) 流動相b(％) 0-10 95-85 5-15 10-20 85-77 15-23 20-25 77-60 23-40 25-35 60-45 40-55 35-45 45-40 55-60 45-55 40-30 60-70 55-60 30-0 70-100

59、流速：0.2-0.4ml/min；

60、柱溫：30-40℃；

61、進樣體積：4-6μl。

62、質(zhì)譜條件：

63、離子源：esi離子源，負(fù)離子模式掃描，離子掃描范圍為m/z?100-1000；

64、碎裂電壓：階升，75m/z-90v，250m/z-100v，450m/z-110v，750m/z-120v，1000m/z-130v；

65、掃描/駐留時間：563ms；

66、干燥器流量：11.0l/min，干燥器溫度：325℃；

67、霧化氣壓力：50.0psi；

68、毛細(xì)管電壓：3.5kv(正離子模式)，-3.5kv(負(fù)離子模式)；

69、毛細(xì)管電流：5na，室電流：0.04μa。

70、優(yōu)選地，步驟3.3中uplc-qtof的條件：

71、色譜條件：同步驟3.1中hplc-ms的色譜條件。

72、質(zhì)譜條件：

73、離子源：esi離子源，分別采用負(fù)離子模式掃描；

74、霧化氣體：氮氣，curtain?gas為30psi；gas?1為55psi；gas?2為55psi；

75、isvf為-4.5kv；ce為-10v；dp為-80v；tem為550℃；

76、離子掃描范圍：m/z?50-1500。

77、本發(fā)明第五方面提供了一種由上述方法得到的碳酸酐酶抑制劑，所述碳酸酐酶抑制劑包括紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸a、丹酚酸b和丹酚酸c中的一種或幾種。

78、本發(fā)明第六方面提供了一種由上述方法得到的碳酸酐酶抑制劑在制備治療和/或預(yù)防血管疾病、高原病、眼部疾病或骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。

79、優(yōu)選地，所述眼部疾病包括高眼壓癥。

80、本發(fā)明對所述的高原病沒有特別限制，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的即可，例如因海拔升高所引起的慢性高原病、急性高原病以及高原反應(yīng)如頭痛、頭暈、惡心、嗜睡、氣促、心慌、嘔吐、乏力、失眠、手足麻木或心率失常等。

81、本發(fā)明對所述的高眼壓癥沒有特別限制，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的即可，例如青光眼、白內(nèi)障或黃斑水腫等。

82、所述用于治療和/或預(yù)防血管疾病、高原病、眼部疾病或骨質(zhì)疏松的藥物中均包括丹酚酸c和至少一種藥用輔料。

83、所述的藥用輔料指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥用輔料，包括填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、香味劑或甜味劑等。

84、所述填充劑可采用淀粉、蔗糖或微晶纖維素；所述粘合劑可采用淀粉漿、羥丙纖維素、明膠或聚乙二醇；所述濕潤劑可采用硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇類；所述吸收促進劑可采用聚山梨脂或卵磷脂；所述表面活性劑可采用伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦或聚山梨脂。

85、所述用于治療和/或預(yù)防血管疾病的藥物、用于治療和/或預(yù)防高原病的藥物、用于治療和/或預(yù)防高眼壓癥及其引起的眼部疾病的藥物和用于治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松及其并發(fā)癥的藥物的劑型均可以是片劑、丸劑、粉劑、分散片、小藥囊劑、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣霧劑、軟膠囊、硬膠囊、無菌注射液、搽劑或栓劑；均可制成常規(guī)、速釋、緩釋或延遲釋放制劑。

86、所述用于治療和/或預(yù)防血管疾病的藥物、用于治療和/或預(yù)防高原病的藥物、用于治療和/或預(yù)防高眼壓癥及其引起的眼部疾病的藥物和用于治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松及其并發(fā)癥的藥物均還可以通過各種途徑給予，包括：口服、鼻腔、肌肉注射、皮下注射或靜脈注射等。

87、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

88、1、本發(fā)明所提供的交聯(lián)的碳酸酐酶相比基于載體的固化酶技術(shù)制備方法簡單、成本低的同時穩(wěn)定性好以及酶活性高。

89、2、本發(fā)明基于交聯(lián)的碳酸酐酶提供的從丹參酚酸中篩選碳酸酐酶抑制劑的方法，能夠快速、準(zhǔn)確的捕獲丹參酚酸組分中能夠抑制碳酸酐酶的活性成分，在lc-ms技術(shù)的輔助下進行鑒定，大大縮短了中藥活性成分中碳酸酐酶抑制劑發(fā)現(xiàn)的周期，同時降低了配體垂釣方法的使用門檻。

90、3、本發(fā)明采用基于交聯(lián)的碳酸酐酶提供的從丹參酚酸中篩選碳酸酐酶抑制劑的方法，首次發(fā)現(xiàn)了丹酚酸c能夠抑制碳酸酐酶，為新型碳酸酐酶抑制藥物的開發(fā)提供了依據(jù)。