本發(fā)明涉及一種以pet水解液為原料高產(chǎn)pet降解酶的基因工程菌及應(yīng)用，屬于微生物工程。

背景技術(shù)：

1、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(pet)是塑料的一種，因其具有高機(jī)械強(qiáng)度、低透氣性、重量輕、成本價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，目前已在全世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。大量pet廢棄物在自然狀態(tài)下難以降解，導(dǎo)致pet在全球生態(tài)體系中積累使得土地營(yíng)養(yǎng)成分流失土壤板結(jié)，并且大量漂流在海洋上的塑料會(huì)對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)造成不利影響。

2、據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球瓶級(jí)pet的產(chǎn)量由2014年的1976萬噸躍至2022年的3021萬噸，pet全球需求的不斷增長(zhǎng)和對(duì)環(huán)境的持續(xù)負(fù)面影響，使pet塑料的積累成為了一個(gè)日益關(guān)注的問題，因此急需開拓新技術(shù)實(shí)現(xiàn)塑料的循環(huán)經(jīng)濟(jì)。

3、生物循環(huán)通過微生物解聚是目前研究的熱點(diǎn)方法，是目前認(rèn)為最有前景的降解方案，利用微生物或酶進(jìn)行降解，產(chǎn)生含對(duì)苯二甲酸(tpa)和乙二醇(eg)的水解液。其中，tpa單體可經(jīng)堿溶酸沉獲得，工藝簡(jiǎn)單、成本低。而水解液中的eg則需要精餾獲得，分離成本高。因此，殘留在pet水解液中的eg的高值化研究逐漸受到關(guān)注，如果能實(shí)現(xiàn)以pet水解液為原料獲得高附加值的產(chǎn)品，將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。目前，將eg作為微生物的發(fā)酵原料仍然存在難點(diǎn)，能有效進(jìn)行eg代謝的工程菌較少，若能開發(fā)高效利用殘留pet水解液中eg作為碳源用于pet降解酶等重組蛋白的表達(dá)的工程菌株，則可實(shí)現(xiàn)pet-eg的連續(xù)進(jìn)行。不僅能降低純化單體產(chǎn)物的成本，也使pet降解物的利用進(jìn)一步提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明基于代謝工程，構(gòu)建以pet水解液為原料高產(chǎn)pet降解酶的基因工程菌，可通過代謝eg產(chǎn)降解酶。

2、本發(fā)明提供了具有乙二醇代謝基因及pet降解酶基因的多核苷酸序列，從5'端向3'端順序含有啟動(dòng)子、乙二醇代謝基因和petase合成基因；所述的乙二醇代謝基因是來源于escherichia?coli?mg1655的l-1,2丙二醇氧化還原酶基因fuco和醛脫氫酶基因alda。

3、在一種實(shí)施方式中，fuco基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，alda基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

4、在一種實(shí)施方式中，所述petase合成基因?yàn)榧?xì)菌hr29來源的bhrpetase基因(核苷酸序列如seq?id?no.4所示)、ideonella?sakaiensis?201-f6來源的petase突變體fastpetase基因(核苷酸序列如seq?id?no.8所示)、ideonella?sakaiensis?201-f6來源的petase突變體durapetase基因(核苷酸序列如seq?id?no.9所示)或thermobifida?fusca來源的角質(zhì)酶tfu_0883突變體4mz基因(核苷酸序列如seq?id?no.10所示)。

5、在一種實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子為pgyra、ptac或pt7。

6、在一種實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子pgyra核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

7、在一種實(shí)施方式中，啟動(dòng)子和fuco基因之間具有rbs序列，rbs序列的核苷酸序列為tttgtttaactttaagaaggaga(seq?id?no.11所示)。

8、在一種實(shí)施方式中，所述的eg代謝基因具有將eg轉(zhuǎn)化為乙醇酸的功能。

9、在一種實(shí)施方式中，所述pet降解酶為細(xì)菌hr29來源的bhrpetase，核苷酸序列如seqid?no.4所示。

10、在一種實(shí)施方式中，所述pet降解酶下游具有終止子。

11、在一種實(shí)施方式中，所述終止子為teminator_1、teminator_2或teminator_3。

12、在一種實(shí)施方式中，所述teminator_1核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述teminator_2核苷酸序列如seq?id?no.6所示；所述teminator_3核苷酸序列如seq?id?no.7所示。

13、在一種實(shí)施方式中，所述多核苷酸序列具有“pgyra-rbs-fuco-alda-petase合成基因-terminator”所示結(jié)構(gòu)。

14、本發(fā)明還提供了含有所述多核苷酸序列的重組表達(dá)載體。

15、在一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體以pacycduet-1為質(zhì)粒骨架。

16、本發(fā)明提供了含有所述重組表達(dá)載體的重組微生物細(xì)胞。

17、在一種實(shí)施方式中，所述微生物細(xì)胞包括大腸桿菌細(xì)胞或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。

18、在一種實(shí)施方式中，所述大腸桿菌為e.coli?bl21(de3)、e.coli?jm109、e.colidh5α或e.coli?top10。

19、在一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌168，枯草芽孢桿菌ws9或枯草芽孢桿菌atcc?6051a。

20、在一種實(shí)施方式中，所述重組微生物細(xì)胞以pacyaduet-1為載體，表達(dá)pet降解酶表達(dá)框；所述pet降解酶表達(dá)框含有“pgyra+rbs+fuco+alda+petase合成基因+終止子terminator_1”所示序列。

21、本發(fā)明還提供了一種制備pet降解酶的方法，是將所述重組微生物細(xì)胞在含有乙二醇的液體環(huán)境下培養(yǎng)。

22、在一種實(shí)施方式中，所述方法是將所述重組微生物細(xì)胞在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，收集菌體細(xì)胞，再將菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含乙二醇的環(huán)境中培養(yǎng)。

23、在一種實(shí)施方式中，所述含有乙二醇的液體環(huán)境包括但不限于pet水解液。

24、在一種實(shí)施方式中，所述含有乙二醇的液體環(huán)境包括但不限于含乙二醇的m9培養(yǎng)基。

25、在一種實(shí)施方式中，所述含有乙二醇的液體環(huán)境是pet水解液與m9培養(yǎng)基的混合液。

26、在一種實(shí)施方式中，所述含有eg的液體環(huán)境中eg含量為3～100mg/ml。

27、在一種實(shí)施方式中，所述pet水解液是pet制品(飲料瓶、聚酯纖維等)經(jīng)降解后的含eg的溶液。

28、在一種實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)是在≥25℃，培養(yǎng)至少48h。

29、在一種實(shí)施方式中，培養(yǎng)溫度為25～40℃。

30、在一種實(shí)施方式中，所述接種量按菌體濕重與溶液體積的質(zhì)量體積百分比(wt％)計(jì)，具體為1～12％，或2～12％，或4～12％，或6～12％，或8～12％，或1～6％，或2～6％，或4～6％。

31、在一種實(shí)施方式中，所述方法是將所述基因工程菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-12h，收集菌體細(xì)胞，以6wt％的轉(zhuǎn)接量接種到含eg或pet水解液的反應(yīng)體系中，轉(zhuǎn)化過程控制ph在7.0-8.0，溫度25-30℃，轉(zhuǎn)化48-72h。

32、本發(fā)明還要求保護(hù)含有所述基因工程菌的微生物制劑。

33、在一種實(shí)施方式中，所述微生物制劑含有所述基因工程菌的活細(xì)胞。

34、本發(fā)明還要求保護(hù)所述重組微生物細(xì)胞在參與生物循環(huán)中的應(yīng)用。

35、在一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用包括但不限于利用pet水解液制備pet降解酶或其他重組蛋白中的應(yīng)用。

36、有益效果：

37、(1)本發(fā)明提供了含有eg代謝和pet降解酶合成表達(dá)單元的質(zhì)粒，可以使宿主細(xì)胞具有代謝eg和合成pet降解酶的能力，實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞將eg轉(zhuǎn)化為乙醇酸進(jìn)入中心代謝并表達(dá)pet降解酶的效果。本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)?？稍诖竽c桿菌、枯草芽孢桿菌等常用宿主中使用，構(gòu)建的重組菌株可代謝eg來合成petase，相比傳統(tǒng)底物葡萄糖，具有更加有效的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

38、(2)本發(fā)明構(gòu)建的重組微生物可用于聚酯塑料制品的分解，由于乙二醇是pet水解液中一個(gè)潛在的底物替代物，本發(fā)明構(gòu)建的菌株能夠在pet回收利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)中利用pet水解液用于petase的表達(dá)，有助于實(shí)現(xiàn)塑料的生物降解，并將塑料降解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為petase進(jìn)一步用于pet降解。

39、(3)本發(fā)明優(yōu)化了代謝eg合成petase的重組菌株的發(fā)酵條件，并在3噸發(fā)酵罐水平驗(yàn)證了菌株的工業(yè)化應(yīng)用效果。在發(fā)酵108h時(shí)pet降解酶酶活力可達(dá)1542.2u/ml，蛋白濃度達(dá)到9.6g/l，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。