本技術涉及生物分子檢測，特別是涉及用于狼瘡腎炎診斷的生物標志物及其應用。

背景技術：

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic?lupus?erythematosus，sle)是一種常見的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以多種自身抗體的產生、全身多器官多系統(tǒng)受累、致殘率高為主要臨床特點。隨著近代免疫學的蓬勃發(fā)展，系統(tǒng)性紅斑狼瘡作為系統(tǒng)性自身免疫性疾病的原型，成為風濕免疫學領域研究的熱點與重點。研究顯示，30-80％的sle患者會發(fā)展為狼瘡腎炎(lupus?nephritis，ln)，常常導致慢性腎臟疾病(chronic?renal?disease，ckd)和終末期腎臟疾病(end?stage?renal?disease，esrd)。在臨床上通常選用激素和免疫抑制劑來治療，但一部分ln患者對于藥物不敏感，轉化成為慢性腎炎，僅能存活5-10年。并且，激素治療也會產生較大副作用。有些患者病情進展極其迅速，生存的時間僅為2-3年。

2、目前，腎組織學活檢仍然是確診和區(qū)分不同階段ln的黃金標準；然而，腎活檢存在諸多弊端和問題，如獲取的組織較少，如果腎臟病變呈現(xiàn)局灶性或者分布不均，有可能因為出現(xiàn)偏差而導致誤診；并且，腎組織學活檢術后可能留下創(chuàng)傷，容易加重血尿，嚴重者甚至引發(fā)大出血導致死亡。腎穿刺可以明確腎病的病理類型，對臨床研究有一定幫助，但對患者的臨床治療指導意義不大，禁忌癥較多，很多患者都不宜采用腎穿刺。2008年，美國俄亥俄州克利夫蘭醫(yī)療中心的萊恩(lane)等報告了2001年之前發(fā)表的關于腎腫物穿刺活檢的英文文獻系統(tǒng)評價結果；在該系統(tǒng)評價中，穿刺所獲組織量不足以進行病理診斷定義為穿刺失敗，穿刺所獲組織與手術切除標本的病理診斷不相符定義為穿刺不準確。研究者共收集到相關文獻27篇，包括2474例病例，結果顯示，穿刺活檢假陰性率平均為4.4％(0～25％)，假陽性率平均為1.2％(0～8.2％)，穿刺失敗率平均為8.9％(0～22％)，病理無法確診率平均為5.5％(0～36％)，診斷的準確率平均為88.9％(40％～100％)，腎腫物穿刺活檢并發(fā)癥發(fā)生率<5％，包括出血、感染、動靜脈瘺、氣胸等。腎穿刺后進行ct發(fā)現(xiàn)，85％～90％的患者均有腎周出血，但只有1％～2％的患者需要輸血。

3、目前臨床還沒有建立診斷和指導ln治療的無創(chuàng)方法。傳統(tǒng)的sle生物標志物如抗dna抗體和補體缺陷被廣泛接受作為評估sle活動性的診斷工具。到目前為止，雙鏈抗dna抗體(anti-dsdna)和血清補體是唯一的監(jiān)測ln患者腎臟活動的非侵入性常規(guī)生物標志物。然而，這些標志物僅是疾病免疫活動的反映，而不是腎損害或預后不良的標志物。

4、因此，持續(xù)深入挖掘狼瘡腎炎的潛在治療或診斷靶點，探索靶點作用機制、推進新藥研發(fā)及臨床轉化，對狼瘡腎炎診斷和治療都具有重大意義。

技術實現(xiàn)思路

1、本技術的目的是提供一種新的狼瘡腎炎生物標志物及其應用。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本技術采用了以下技術方案：

3、本技術的第一方面公開了egln1、fam129c和fcrl2作為狼瘡腎炎生物標志物的應用；或者檢測以下一個或多個生物標志物水平的試劑在制備狼瘡腎炎診斷產品中的應用，所述生物標志物包括egln1、fam129c和fcrl2。

4、需要說明的是，本技術的關鍵在于研究發(fā)現(xiàn)egln1、fam129c和fcrl2在狼瘡腎炎患者和健康人之間皆存在表達差異，并驗證了這種表達差異僅在狼瘡腎炎患者中存在，而在無狼瘡腎炎的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中則沒有差異表達，egln1、fam129c和fcrl2皆可以作為狼瘡腎炎診斷的獨立指征。因此，本技術創(chuàng)造性的提出將egln1、fam129c和fcrl2作為狼瘡腎炎生物標志物；在此基礎上，可以將檢測egln1、fam129c和fcrl2的試劑作為狼瘡腎炎診斷試劑，即將獲取樣本中egln1、fam129c或fcrl2水平的檢測試劑或組件用于制備狼瘡腎炎診斷產品。

5、本技術的一種實現(xiàn)方式中，用于診斷狼瘡腎炎的生物標志物包含egln1、fam129c、fcrl2的一個或多個。

6、進一步地，egln1、fam129c和fcrl2皆可以作為狼瘡腎炎診斷的獨立指征。

7、還需要說明的是，本技術將egln1、fam129c和fcrl2作為狼瘡腎炎生物標志物，可以是核酸或者蛋白，例如根據生物標志物的核酸表達水平，或生物標志物的蛋白表達水平，診斷狼瘡腎炎。其中，核酸表達水平可以通過檢測dna、rna或mrna判斷；蛋白表達水平可以通過檢測蛋白與其特異性多肽相互結合的水平表征。本技術中，分析對象可以是采集的樣本，例如通過檢測采集的樣本中的生物標志物核酸表達水平或蛋白表達水平，診斷狼瘡腎炎；或者，根據現(xiàn)有數(shù)據直接分析生物標志物的核酸表達水平或蛋白表達水平，以此診斷狼瘡腎炎。

8、進一步地，核酸水平或蛋白水平包括但不限于核酸或蛋白的豐度或濃度，在一些方面還可以包括諸如核酸或蛋白的突變豐度或濃度。

9、進一步地，本技術的核酸水平通過測序技術、核酸擴增技術、核酸雜交技術、電泳技術、生物質譜技術或色譜技術獲取。

10、進一步地，核酸水平獲取方法包括但不限于以下任一種方法：基因測序法、聚合酶鏈式反應法、等溫擴增反應法、基因芯片法、探針雜交法、凝膠電泳法、rna印跡法、核酸質譜法或液相色譜法。

11、進一步地，本技術的蛋白水平通過測序技術、免疫技術、電泳技術、生物質譜技術或色譜技術獲取。

12、進一步地，蛋白水平獲取方法包括但不限于以下任一種方法：氨基酸測序法、酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光法、免疫層析法、放射免疫法、免疫組化法、免疫印跡法、流式細胞術、凝膠電泳法、蛋白質譜法或液相色譜法。

13、本技術的第二方面公開了一種用于狼瘡腎炎診斷的產品，該產品中含有檢測生物標志物核酸的試劑和/或檢測生物標志物蛋白的試劑，前述生物標志物選自egln1、fam129c和fcrl2的一個或多個。

14、在一些方面，產品包括但不限于試劑盒形式、系統(tǒng)裝置形式、計算機可讀介質或計算機系統(tǒng)形式。

15、需要說明的是，本技術的關鍵在于研究發(fā)現(xiàn)egln1、fam129c或fcrl2可以作為狼瘡腎炎的生物標志物；因此，可以將檢測選自egln1、fam129c和fcrl2中一個或多個生物標志物核酸和/或蛋白的試劑作為狼瘡腎炎診斷產品的組件。

16、本技術的一種實現(xiàn)方式中，檢測生物標志物核酸的試劑包括針對egln1、fam129c或fcrl2核酸設計的特異性引物和/或探針；檢測生物標志物蛋白的試劑包括特異性結合或識別egln1、fam129c或fcrl2蛋白的多肽。

17、需要說明的是，本技術的特異性引物是指針對本技術的生物標志物核酸設計的引物，例如基因測序法的引物、聚合酶鏈式反應法的引物、等溫擴增反應法的引物，或其他能夠檢測本技術的生物標志物核酸的引物；特異性探針是指針對本技術的生物標志物核酸設計的探針，例如實時熒光定量pcr探針、基因芯片檢測探針、探針雜交法的特異性探針，或其他能夠檢測本技術的生物標志物核酸的探針。

18、還需要說明的是，本技術的產品，其關鍵在于針對本技術的生物標志物核酸設計的特異性引物和/或探針，或者特異性結合或識別本技術的生物標志物蛋白的多肽；為了使用方便，檢測本技術的生物標志物核酸的試劑還可以包括與具體采用的檢測方法相對應的常規(guī)試劑或組件，例如基因測序法、聚合酶鏈式反應法、等溫擴增反應法、基因芯片法、探針雜交法、凝膠電泳法、rna印跡法、核酸質譜法或液相色譜法的常規(guī)試劑或組件；同樣的，檢測本技術的生物標志物蛋白的試劑還可以包括氨基酸測序法、酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光法、免疫層析法、放射免疫法、免疫組化法、免疫印跡法、流式細胞術、凝膠電泳法、蛋白質譜法或液相色譜法的常規(guī)試劑或組件?？梢岳斫猓@些與具體采用的檢測方法相對應的常規(guī)試劑或組件，可以通過市售購買獲得，也可以整合到本技術的產品中。

19、本技術的一種實現(xiàn)方式中，本技術的生物標志物核酸包括生物標志物的基因、截取自生物標志物基因的dna片段、生物標志物基因或其dna片段對應的rna、mrna、mirna或lcrna；多肽包括抗體、抗原結合片段、單鏈抗體和與本技術的生物標志物蛋白特異性結合的配體中的至少一種。

20、需要說明的是，本技術的關鍵在于檢測本技術的生物標志物水平，檢測對象可以是本技術的生物標志物核酸，包括各種dna或rna，也可以是本技術的生物標志物蛋白。檢測對象是蛋白時，可以通過各種與之特異性結合的多肽進行檢測，例如包括但不僅限于抗體、抗原結合片段、單鏈抗體、與本技術的生物標志物蛋白特異性結合的配體等。

21、本技術的一種實現(xiàn)方式中，本技術的產品還包括檢測其他標志物的試劑或組件。

22、進一步地，檢測本技術生物標志物的試劑，可以與檢測其他標志物的試劑或組件組合使用。更具體的，其他標志物包括但不限于c3、c4、dsdna、cobll1、cd79b、hla-dob、slpi、gpr18中的一個或多個。

23、在一些方面，本技術的產品還包括樣本的處理試劑。樣本的處理試劑根據具體的樣本而定，例如，更具體的，樣本的處理試劑包括樣本裂解試劑、樣本純化試劑以及樣本提取試劑中的至少一種。

24、進一步地，本技術的產品還包括標準品、校準品、對照品、緩沖液中的至少一種。

25、進一步地，本技術的產品可以根據需要追加含有用于各成分的混合的管、微孔板和記載使用方法的指示資料等。

26、在一些方面，本技術的樣本包括組織、細胞、尿液、唾液、胸水、腹水、糞便、滑液或各種體液。其中，體液是指細胞內液和細胞外液，包括組織液、血漿、血液(例如全血、血清、或血漿)、淋巴液、腦脊液、精液、房水等，在一些實施方式中，樣本包括外周血單核細胞。

27、本技術的第三方面公開了一種診斷狼瘡腎炎的方法，包括以下步驟：

28、(i)獲取待測樣本中的生物標志物水平，前述生物標志物選自以下一個或多個：egln1、fam129c和fcrl2；

29、(ii)將待測樣本中的生物標志物水平與對照樣本中對應的生物標志物水平進行比較，如果存在顯著性差異，則作為待測樣本來源的受試者具有患狼瘡腎炎的指征；或者，將待測樣本中的生物標志物水平與設定的閾值進行比較，如果待測樣本中的生物標志物水平與閾值存在顯著性差異，則作為待測樣本來源的受試者具有患狼瘡腎炎的指征。

30、本技術中，例如，對照樣本為來源于健康人群的樣本，此時，狼瘡腎炎的診斷標準為，待測樣本中本技術的生物標志物水平與對照樣本中對應的生物標志物水平存在顯著性差異?；蛘?，預先根據對照樣本的生物標志物水平設定閾值，將待測樣本中本技術的生物標志物水平與設定的閾值進行比較。因此，本技術中，閾值為根據對照樣本的生物標志物水平設定的閾值，即根據來源于健康人群的樣本中的生物標志物水平設定閾值。

31、進一步地，本技術的生物標志物水平包括核酸水平或蛋白水平。

32、進一步地，本技術的生物標志物egln1、fam129c和fcrl2皆可獨立作為狼瘡腎炎診斷的指征。

33、更進一步地，本技術的生物標志物水平在無狼瘡腎炎的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(noln)中無顯著變化，不能區(qū)分noln患者和正常人群。因此，本技術的生物標志物不僅能夠作為區(qū)分狼瘡腎炎患者(ln)與健康人群的標志物，還能作為區(qū)分noln患者和ln患者的標志物。

34、在一些方面，上述診斷包括但不限于針對狼瘡腎炎的篩查、輔助確診、確診、預測/判斷疾病嚴重程度、評估疾病活動度、監(jiān)測治療。

35、本技術的第四方面公開了一種評價或篩選狼瘡腎炎標志物的方法，包括將候選生物標志物與本技術的生物標志物水平進行相關性或一致性分析，通過相關性或一致性的結論去驗證潛在標志物的診斷價值。

36、可以理解，本技術研究發(fā)現(xiàn)egln1、fam129c或fcrl2可以作為狼瘡腎炎標志物；因此，egln1、fam129c或fcrl2可以作為篩選其他狼瘡腎炎標志物的正對照；例如，根據候選生物標志物與egln1、fam129c或fcrl2水平的相關性或一致性，篩選狼瘡腎炎標志物。

37、需要說明的是，本技術的生物標志物egln1、fam129c和fcrl2皆可獨立作為篩選其他狼瘡腎炎標志物的指征。

38、本技術的第五方面公開了一種評估或篩選狼瘡腎炎治療劑的方法，包括對經治療劑處理后的樣本進行生物標志物水平評價，前述生物標志物選自以下一個或多個：egln1、fam129c和fcrl2。

39、需要說明的是，本技術研究發(fā)現(xiàn)狼瘡腎炎患者和健康人之間的egln1、fam129c和fcrl2皆存在表達差異，因此將前述生物標志物作為狼瘡腎炎標志物；在此基礎上，可以理解，狼瘡腎炎患者如果治療成功，則其egln1、fam129c和fcrl2表達水相對于治療之前也會存在差異。因此，本技術創(chuàng)造性的提出，將egln1、fam129c和fcrl2水平用于評估或篩選狼瘡腎炎治療劑。例如，如果經治療劑處理后，樣本的egln1、fam129c和fcrl2水平顯著低于治療劑處理之前，則判斷治療劑對狼瘡腎炎具有良好的治療效果；反之，則表明治療劑處理前后，狼瘡腎炎患者并沒有改善或者效果不明顯；以此實現(xiàn)狼瘡腎炎治療劑的篩選或者治療劑療效評估。

40、還需要說明的是，本技術的生物標志物egln1、fam129c和fcrl2皆可獨立作為評估或篩選狼瘡腎炎治療劑的指征。

41、本技術中，生物標志物水平是指核酸水平或蛋白水平。例如，核酸水平為dna、rna或mrna的表達水平，蛋白水平為生物標志物的蛋白與其特異性多肽相互結合的水平。

42、進一步地，還包括c3、c4、dsdna、cobll1、cd79b、hla-dob、slpi、gpr18的一個或多個核酸或蛋白。

43、由于采用以上技術方案，本技術的有益效果在于：

44、本技術為狼瘡腎炎提供了一種新的生物標志物，通過分析egln1、fam129c、fcrl2中的一個或多個的水平，能夠有效的區(qū)分狼瘡腎炎患者和正常人群，為狼瘡腎炎的診斷、治療提供了一種新的方案和途徑，彌補了現(xiàn)有狼瘡腎炎臨床無創(chuàng)檢測方法缺失的不足，具有顯著的臨床價值。