本公開提供了以減少的或最少的操作遺傳修飾所選的細(xì)胞類型的納米顆粒。納米顆粒遞送精確基因組工程所需的所有組分并克服與當(dāng)前臨床實(shí)踐相關(guān)的許多缺點(diǎn)以出于治療目的遺傳工程化細(xì)胞。

背景技術(shù)：

1、患者特異性基因療法具有治療遺傳性、感染性和惡性疾病的巨大潛力。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因添加到造血干細(xì)胞(hsc)以及造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(hspc)中在過去10年中已經(jīng)證明了對(duì)幾種遺傳疾病的治療結(jié)果，所述疾病包括遺傳性免疫缺陷(例如，x連鎖和腺苷脫氨酶缺乏的重癥聯(lián)合免疫缺陷(scid))、血紅蛋白病、wiskott-aldrich綜合征和異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良。此外，這種治療方法還改善了不良預(yù)后診斷諸如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的結(jié)果。與來(lái)自供體的細(xì)胞相反，使用基因校正的自體或“自身”細(xì)胞消除了移植物-宿主免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)，從而不需要免疫抑制藥物。

2、目前臨床醫(yī)學(xué)中使用的系統(tǒng)缺乏將基因編輯組分遞送至hsc和hspc以及其他血細(xì)胞類型的最佳方法。例如，crispr-cas9平臺(tái)是臨床環(huán)境中用于hspc中的基因編輯的一種方法。如果目的是基因破壞，則僅需要電穿孔來(lái)遞送基因編輯組分。然而，電穿孔對(duì)許多細(xì)胞類型有毒性，并且在起始細(xì)胞數(shù)低的情況下，這種毒性對(duì)于使用hsc和/或hspc的療法尤其成問題。

3、如果目的是插入新的遺傳物質(zhì)，則必須包括用于同源定向修復(fù)的dna模板。如果新的遺傳物質(zhì)較小，這可以通過在單鏈dna(ssdna)模板中進(jìn)行電穿孔來(lái)實(shí)現(xiàn)，但是對(duì)于較大的模板，使用腺相關(guān)病毒載體(aav)是目前臨床實(shí)踐中的黃金標(biāo)準(zhǔn)。無(wú)論單獨(dú)使用電穿孔還是與aav組合使用電穿孔，都不能保證將要遞送的所有單獨(dú)的基因編輯組分都遞送到相同的細(xì)胞中。此外，電穿孔依賴于細(xì)胞膜的機(jī)械破壞和透化，因此損害了細(xì)胞的活力，使得它們對(duì)于治療性用途來(lái)說不太理想。此外，與基于病毒的方法一樣，電穿孔不能選擇性地將基因從異質(zhì)池中遞送到特定細(xì)胞類型，因此必須在其之前進(jìn)行細(xì)胞選擇和純化過程。細(xì)胞選擇和純化過程是導(dǎo)致不期望的高毒性水平的苛刻過程。最后，當(dāng)細(xì)胞再灌注時(shí)，aav處理具有免疫原性潛力。

4、可簡(jiǎn)化所需步驟并確保將所有組分遞送至預(yù)期細(xì)胞類型的遞送基因編輯組分的任何改進(jìn)方法都將是臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的顯著改進(jìn)。已經(jīng)提出了諸如聚合復(fù)合物和脂質(zhì)體復(fù)合物的納米顆粒，但是這些已經(jīng)表明是有毒性的，證明了有限的基因編輯組分遞送效率以及在hsc和hspc中有限的基因編輯功效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開提供了允許以減少的和最少的操作對(duì)所選細(xì)胞類型進(jìn)行選擇性遺傳修飾的納米顆粒(np)。減少的操作意味著不需要使用電穿孔和病毒載體，諸如aav。最少的操作意味著不需要使用電穿孔、病毒載體以及細(xì)胞選擇和純化過程。此外，本公開還提供了特異性工程化以遞送基因組編輯所需的所有組分的np。np可用于需要功能喪失突變的療法，但重要的是，也可提供基因添加或特定突變的校正所需的所有組分。所描述的方法是安全的(即，沒有脫靶毒性)、可靠的、可擴(kuò)展的、易于制造的、合成的和即插即用的(即，相同的基礎(chǔ)平臺(tái)可用于遞送不同的治療性核酸)。

技術(shù)特征：

1.一種遺傳修飾生物樣品中的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(hspc)群體的方法，其包括向所述生物樣品添加金納米顆粒(aunp)，其中所述aunp包含

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述crrna靶向如seq?id?no:25；seq?id?no:3；seqid?no:24；seq?id?no:26-32；seq?id?no:42；seq?id?no:43；或seq?id?no:214-224中所示的序列。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述crrna具有如seq?id?no:262、seq?id?no:261或seq?id?no:259中所示的序列。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸酶包括cpf1或cas9。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述帶正電荷的聚合物涂層包含

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中au核心與核酸酶的重量/重量(w/w)比為0.6。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中au核心與hdt的w/w比為1.0。

8.一種遺傳修飾生物樣品中所選細(xì)胞群體的方法，其包括向所述生物樣品添加金納米顆粒(aunp)，其中所述aunp包含

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中au核心與核酸酶的重量/重量(w/w)比為0.6。

10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中au核心與hdt的w/w比為1.0。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)涉及遺傳修飾細(xì)胞的減少和最少的操作制造。描述了用于遺傳修飾已進(jìn)行了減少或最少的操作的生物樣品中所選細(xì)胞類型的納米顆粒。所述納米顆粒遞送精確基因組工程所需的所有組分并克服與當(dāng)前臨床實(shí)踐相關(guān)的許多缺點(diǎn)以出于治療目的遺傳工程化細(xì)胞。

技術(shù)研發(fā)人員：J·E·阿達(dá)伊爾,R·沙赫巴齊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：弗萊德哈欽森癌癥中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30