本發(fā)明涉及分子生物，尤其涉及一種谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、中國倉鼠卵巢(cho)細胞是一種來源于中國倉鼠卵巢的上皮細胞系，是生物制藥行業(yè)制造治療性蛋白主要手段之一，也是生產(chǎn)單克隆抗體的主要工具之一?？梢钥焖僮R別大量低產(chǎn)和非生產(chǎn)性細胞中的那些稀有高產(chǎn)細胞系，達成有效和高效的臨床細胞系開發(fā)過程，對于加速生物藥物開發(fā)具有重大意義。

2、在細胞培養(yǎng)中，谷氨酰胺一方面用于細胞的能量代謝，另一方面參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。在沒有或低谷氨酰胺的培養(yǎng)條件下，谷氨酰胺合成酶(gs)催化谷氨酸和銨離子合成生成谷氨酰胺，供給細胞代謝和蛋白質(zhì)合成。甲硫氨酸磺酸鹽(msx)是gs的競爭型抑制劑，msx結(jié)合到gs的谷氨酸鹽位點之后，會被atp磷酸化，從而不可逆的抑制gs活性。gs/msx篩選系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于篩選基于cho細胞的蛋白類藥品工程細胞株。通常目的蛋白基因和gs基因被共同轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，gs基因作為篩選標記基因表達谷氨酰胺合成酶，使陽性細胞能在低或無谷氨酰胺條件下生長。隨后，通過逐漸提高msx的濃度篩選細胞種群中有高拷貝、能高表達gs基因的細胞。這些細胞一般也攜帶更高拷貝數(shù)的目的基因，并能高表達目的基因蛋白。另外利用gs/msx方法構(gòu)建的工程細胞株在培養(yǎng)時無需加入谷氨酰胺，極大減少了代謝廢物-氨在培養(yǎng)基中的積累，具有培養(yǎng)工藝易于優(yōu)化，質(zhì)控容易，蛋白表達量高等優(yōu)點。

3、工業(yè)化生產(chǎn)重組抗體通常選擇敲除了內(nèi)源性的gs基因的cho細胞株作為宿主細胞，雖然其細胞無法在谷氨酰胺缺失的培養(yǎng)基中生長，但外源質(zhì)粒上帶有的gs基因，不僅可以增加在谷氨酰胺缺失的培養(yǎng)基中篩選穩(wěn)定細胞株時的嚴謹性，而且更增強了將廢物銨離子轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺氨基酸的反應(yīng)，對大規(guī)模細胞培養(yǎng)非常有利。

4、目前能夠成熟應(yīng)用于gs基因敲除的生物技術(shù)主要有四種：同源重組、鋅指核酸酶(zfn)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(talen)以及原核生物后天免疫系統(tǒng)(簇間規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列，crispr)。傳統(tǒng)的同源重組法通過構(gòu)建基因打靶載體，利用左右同源臂的重組，實現(xiàn)外源基因替代目的基因片段。雖然這種方法容易實施，但是打靶效率非常低，理論上同源重組事件僅發(fā)生在宿主細胞基因組復(fù)制進行的短促時間段。據(jù)統(tǒng)計，在小鼠的胚胎干細胞(es)中同源重組的效率僅在百萬分之一，而在cho細胞中同源重組的效率甚至遠低于es細胞。zfn、talen，以及crispr技術(shù)的成功發(fā)明與改進，極大地方便了科研人員對于原核細胞、真核細胞等進行基因組層面的細微精準操作，在構(gòu)建時間和敲除效率上，較傳統(tǒng)的同源重組而言，zfn、talen以及crispr三大編輯技術(shù)明顯更具優(yōu)勢。然而這三種方法仍然受其原理機制的限定，均具有不同程度且不可忽視的脫靶效應(yīng)。簡言之，這三種方法僅依靠非常簡短的引導(dǎo)單元或引導(dǎo)序列，定位到目的序列附近，在核酸酶的作用下完成基因組的切割，容易因錯配導(dǎo)致核酸酶對非目標區(qū)域進行切割。單就cho細胞基因組而言，對于一個標準的gn19ngg靶標序列，cho-k1的基因組中平均有6個完全相同的序列、377個有一個核苷酸誤配的序列、4558個有兩個核苷酸誤配的序列。用crispr技術(shù)定點改造基因而獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠在全基因組層面甚至出現(xiàn)多達1397個單核苷酸突變和117處dna序列的插入或缺失。如此多的遺傳和表觀不確定性，使得該法產(chǎn)生的敲除細胞株難以作為醫(yī)用蛋白生產(chǎn)的通用性工程細胞株，并且較難獲得國家藥監(jiān)局和美國食品藥品監(jiān)督局的許可。

5、cn116716253a公開了一種gs基因敲除的cho細胞株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。所述gs基因敲除的cho細胞株的構(gòu)建方法，采用的sgrna截短成17bp，其敲除效率相較于傳統(tǒng)長度的20bp?sgrna，略有提升，但是未能根本上解決或避免如何降低crispr技術(shù)的脫靶效應(yīng)。

6、綜上所述，如何提供一種在安全性、敲除精準度、脫靶效應(yīng)、敲除效率和篩選效率等方面都兼?zhèn)鋬?yōu)勢、且真正被生物制藥行業(yè)接受應(yīng)用于實際cho細胞工程株改造的方法，已成為目前本領(lǐng)域亟待解決的問題之一。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的方法極大地提高了傳統(tǒng)同源重組的打靶效率，顯著降低傳統(tǒng)同源重組法非特異性整合的概率。同時本發(fā)明提供的敲除陽性細胞系篩選方法，能較易獲得無抗性篩選標記殘留谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除陽性cho細胞系，提高篩選效率，并且敲除獲得的細胞系倍增快，密度高，產(chǎn)量高，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞池pool可達g/l級別。

2、為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種同源重組打靶序列，所述同源重組打靶序列的核酸序列包括seq?id?no.1所示的序列。

4、seq?id?no.1：tggcagggatatcgtggaggctcactaccgcgcctgcttgtatgctggggtcaagattacaggaacaaatgct?gaggtcatgcctgcccaggtaaatggcactattctgttccttttcctcccctctgaagacttggcacatggggactttggttaacaagggtgatgacttaaaagtggttcagggtagaggtaagtagaacaagctaggagcttgagttggcctgaacagttagttggccttattctaaaggtcaacatgttctttctagtgggaattccaaataggaccctgtgaagataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaataacttcgtatagcatacattatacgaagttattgggaactggaatggtgcaggctgccataccaactttagcaccaaggccatgcgggaggagaatggtctgaagtaagtagcttcctctggagccatctttattctcatggggtggaagggctttgtgttagggttgggaaagttggacttctcacaaactacatgccatgctcttcgtgtttgtcataagcctatcgttttgtacccgttggagaagtgacagtactctaggaatagaattacagctgtgatatgggaaagttgtcacgtaggttcaagcatttaaaggtctttagtaagaactaaatacacatacaagcaagtgggtgacttaattcttactgatgggaagaggccagtgatgggggtcttcccatccaaaagataattggtattgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatggcctcgtaccccggccatcaacacgcgtctgcgttcgaccaggctgcgcgttctcgcggccatagcaaccgacgtacggcgttgcgccctcgccggcagcaagaagccacggaagtccgcccggagcagaaaatgcccacgctactgcgggtttatatagacggtccccacgggatggggaaaaccaccaccacgcaactgctggtggccctgggttcgcgcgacgatatcgtctacgtacccgagccgatgacttactggcgggtgctgggggcttccgagacaatcgcgaacatctacaccacacaacaccgcctcgaccagggtgagatatcggccggggacgcggcggtggtaatgacaagcgcccagataacaatgggcatgccttatgccgtgaccgacgccgttctggctcctcatatcgggggggaggctgggagctcacatgccccgcccccggccctcaccctcatcttcgaccgccatcccatcgccgccctcctgtgctacccggccgcgcggtaccttatgggcagcatgaccccccaggccgtgctggcgttcgtggccctcatcccgccgaccttgcccggcaccaacatcgtgcttggggcccttccggaggacagacacatcgaccgcctggccaaacgccagcgccccggcgagcggctggacctggctatgctggctgcgattcgccgcgtttacgggctacttgccaatacggtgcggtatctgcagtgcggcgggtcgtggcgggaggactggggacagctttcggggacggccgtgccgccccagggtgccgagccccagagcaacgcgggcccacgaccccatatcggggacacgttatttaccctgtttcgggcccccgagttgctggcccccaacggcgacctgtataacgtgtttgcctgggccttggacgtcttggccaaacgcctccgttccatgcacgtctttatcctggattacgaccaatcgcccgccggctgccgggacgccctgctgcaacttacctccgggatggtccagacccacgtcaccacccccggctccataccgacgatatgcgacctggcgcgcacgtttgcccgggagatgggggaggctaactgaaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatctta。

5、本發(fā)明使用的同源重組打靶序列包括左同源臂、loxp序列、sv40啟動子、neor序列、loxp序列、右同源臂、sv40啟動子和hsv-tk序列，其中左同源臂長度為目的基因刪除片段的3倍，右同源臂長度為目的基因刪除片段的4倍，目的基因刪除片段位于cho細胞谷氨酰胺合成酶基因的第六外顯子區(qū)域內(nèi)，目的基因刪除片段堿基長度非3的整倍數(shù)，loxp序列是cre重組酶的識別位點，neor序列是正篩選序列，hsv-tk序列是負篩選序列。

6、第二方面，本發(fā)明提供了一種谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系的制備方法，所述制備方法包括：使用第一方面所述的同源重組打靶序列敲除cho細胞的谷氨酰胺合成酶基因。

7、優(yōu)選地，所述打靶序列的dna包含于重組腺相關(guān)病毒載體中。

8、優(yōu)選地，所述重組腺相關(guān)病毒載體為aav2基因組與衣殼蛋白結(jié)合產(chǎn)生的載體。

9、優(yōu)選地，所述制備方法具體包括以下步驟：

10、(1)使用重組腺相關(guān)病毒遞送所述打靶序列至cho細胞核中，打靶序列與谷氨酰胺合成酶基因的第六外顯子區(qū)域目的片段特異性同源重組，敲除cho細胞的谷氨酰胺合成酶基因，使用正負篩選系統(tǒng)篩除非特異性打靶事件，使用cre重組酶去除篩選標記，使用qpcr檢測篩選標記的整合與脫去頻率，獲得谷氨酰胺合成酶單等位基因敲除cho細胞系；

11、(2)重復(fù)步驟(1)，使用谷氨酰胺細胞增殖對比實驗快速篩選雙敲除概率事件，最終獲得谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系。

12、本發(fā)明采用重組腺相關(guān)病毒載體raav遞送上述打靶序列入核介導(dǎo)同源重組、位點特異性重組酶cre/loxp系統(tǒng)以及正負篩選系統(tǒng)三方聯(lián)合篩選策略，構(gòu)建無抗性篩選標記的gs雙等位基因敲除cho細胞系，顯著提高以同源重組為基礎(chǔ)方法的基因敲除打靶效率以及顯著降低非特異性整合事件，較易獲得無抗性篩選標記殘留谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除陽性cho細胞系，從而更有效地規(guī)避打靶序列非特異性整合帶來的潛在風(fēng)險。

13、優(yōu)選地，所述谷氨酰胺合成酶基因的第六外顯子區(qū)域的核酸序列包括seq?idno.2所示的序列。

14、seq?id?no.2：tgggaattccaaataggaccctgtgaaggaatccgcatgggagatcatctctgggtggcccgtttcatcttgcat?cgagtatgtgaagactttggggtaatagcaacctttgaccccaagcccattcctgggaactggaatggtgcaggctgccataccaactttagcac?caaggccatgcgggaggagaatggtctgaa。

15、優(yōu)選地，步驟(1)所述獲得谷氨酰胺合成酶單等位基因敲除cho細胞系前，還包括單克隆化的步驟。

16、優(yōu)選地，步驟(2)所述獲得谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系前，還包括單克隆化的步驟。

17、優(yōu)選地，所述去除篩選標記和單克隆化前，還包括使用熒光定量pcr，檢測分析細胞池中陽性整合打靶序列的克隆比例和去篩選標記陽性敲除目的基因的克隆比例。

18、優(yōu)選地，獲取所述熒光定量pcr檢測過程中用到的pcr引物的核酸序列包括seq?idno.3～seq?id?no.6所示的序列。

19、seq?id?no.3：ccggctacctgcccattcg。

20、seq?id?no.4：tggcgaacagttcggctggc。

21、seq?id?no.5：tctatgagggctacgctctcc。

22、seq?id?no.6：acgctcggtcaggatcttca。

23、優(yōu)選地，所述cre重組酶的氨基酸序列包括seq?id?no.13所示的序列。

24、seq?id?no.13：msnlltvhqnlpalpvdatsdevrknlmdmfrdrqafsehtwkml?lsvcrswaawcklnnrkwfpaepedvrdyllylqarglavktiqqhlgqlnmlhrrsglprpsdsnavslvmrrirkenvdagerakqalafertdfdqvrslmensdrcqdirnlaflgiayntllriaeiarirvkdisrtdggrmlihigrtktlvstagvekalslgvtklverwisvsgvaddpnnylfcrvrkngvaapsatsqlstralegifeathrliygakddsgqrylawsghsarvgaardmaragvsipeimqaggwtnvnivmnyirnldsetgamvrlledgd。

25、優(yōu)選地，所述獲得谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系前，還包括獲取單克隆cho細胞系的基因組dna，通過基因組dna的測序數(shù)據(jù)篩選所述谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系。

26、優(yōu)選地，所述測序數(shù)據(jù)為巢式pcr測序數(shù)據(jù)。

27、優(yōu)選地，獲取所述測序數(shù)據(jù)過程中用到的巢式pcr引物的核酸序列包括seq?idno.7～seq?id?no.12所示的序列。

28、seq?id?no.7：gctgtcttgtgaatagagggt。

29、seq?id?no.8：catggcatgtagtttgtgagaa。

30、seq?id?no.9：cagcgtgcagataggatgaa。

31、seq?id?no.10：catggccttggtgctaaagtt。

32、seq?id?no.11：ccttgtcattttctggctttg。

33、seq?id?no.12：gtccgtattactgtggtgtg。

34、第三方面，本發(fā)明提供了一種谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系，所述谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系由第二方面所述的谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系的制備方法制備得到。

35、優(yōu)選地，所述細胞系含有編碼目的蛋白的核酸分子。

36、優(yōu)選地，所述目的蛋白包括抗體。

37、優(yōu)選地，所述核酸分子游離于經(jīng)改造的cho細胞系的基因組之外或整合在基因組上。

38、優(yōu)選地，所述谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系瞬時表達或穩(wěn)定表達目的蛋白。

39、優(yōu)選地，所述谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系用于分批培養(yǎng)或流加培養(yǎng)。

40、第四方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的同源重組打靶序列、第二方面所述的谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系的制備方法、第三方面所述的谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系中的任意一種或至少兩種的組合在表達目的蛋白或制備表達目的蛋白的工程化細胞中的應(yīng)用。

41、優(yōu)選地，所述目的蛋白包括抗體。

42、第五方面，本發(fā)明提供了一種表達目的蛋白的方法，所述表達目的蛋白的方法包括以下步驟：

43、(1)將編碼所述目的蛋白的核酸分子導(dǎo)入第三方面所述的谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系中；

44、(2)培養(yǎng)所述谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除cho細胞系，表達所述目的蛋白。

45、優(yōu)選地，所述目的蛋白包括抗體。

46、優(yōu)選地，步驟(1)所述導(dǎo)入的方法包括使用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)染。

47、優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)染試劑包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑。

48、優(yōu)選地，步驟(1)所述核酸分子包含于表達載體中。

49、優(yōu)選地，所述表達載體包括質(zhì)粒。

50、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

51、本發(fā)明創(chuàng)造性地提供一種同源重組打靶序列，采用目的基因刪除片段3倍長度的左同源臂，以及目的基因刪除片段4倍長度的右同源臂對目標序列進行同源打靶。所述目的基因刪除片段位于cho細胞谷氨酰胺合成酶基因的第六外顯子區(qū)域內(nèi)，所述目的基因刪除片段堿基長度非3的整倍數(shù)。通過raav遞送上述打靶序列入核增加同源重組概率，在位點特異性重組酶cre/loxp系統(tǒng)以及正負篩選系統(tǒng)三方聯(lián)合篩選策略下，采用熒光定量pcr、谷氨酰胺增值對比依賴性實驗和單克隆化細胞巢氏pcr測序法提高gs敲除cho細胞系的篩選效率。本發(fā)明提供的方法采用一種特殊設(shè)計的同源打靶序列，并通過重組腺相關(guān)病毒遞送其入核，成功解決了傳統(tǒng)同源重組的打靶效率低的問題，使用正負篩選系統(tǒng)在篩選細胞株的過程中，篩除了因非特異性打靶產(chǎn)生的假陽性克隆，因此脫靶率低，通過cre重組酶系統(tǒng)較易去除篩選標記，通過熒光定量pcr、谷氨酰胺增值對比依賴性實驗方法能較快獲得無抗性篩選標記殘留谷氨酰胺合成酶雙等位基因敲除陽性cho細胞系，敲除獲得的細胞系倍增快，密度高，產(chǎn)量高，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞池pool可達g/l級別。