本發(fā)明屬于高通量測(cè)序及基因檢測(cè)，涉及一種用于檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的引物、方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、女性的陰道是一個(gè)以乳酸菌屬為優(yōu)勢(shì)菌的復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)。若陰道中的正常菌群失調(diào)，乳酸桿菌減少或消失，兼性厭氧菌及厭氧菌增多則會(huì)導(dǎo)致陰道感染，進(jìn)而發(fā)生炎癥，臨床上稱其為細(xì)菌性陰道病(bacterial?vaginosis,bv)。該病多發(fā)于育齡期女性，是婦科常見疾病之一。

2、目前，bv的診斷主要是基于amsel臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)及革蘭染色nugent評(píng)分診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，amsel診斷標(biāo)準(zhǔn)為以下4項(xiàng)臨床指標(biāo)中至少有3項(xiàng)為陽性即診斷bv，(1)陰道分泌物呈現(xiàn)稀薄、均質(zhì)、灰白色或黃色；(2)在加入10％氫氧化鉀溶液后釋放出魚腥臭味；(3)鏡檢線索細(xì)胞數(shù)量＞20％陰道上皮細(xì)胞總量；(4)陰道分泌物ph>4.5。其中線索細(xì)胞陽性必須符合。nugent評(píng)分則是對(duì)陰道樣本涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，檢驗(yàn)人員通過對(duì)染色后的細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行鑒別統(tǒng)計(jì)評(píng)分，結(jié)果可分為正常(0～3分)、bv中間態(tài)(4～6分)和bv(7～10分)。兩種診斷方法操作均需要一定的技巧，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)人員，其中amsel診斷標(biāo)準(zhǔn)雖然相對(duì)簡(jiǎn)單，但是對(duì)于某些細(xì)菌的檢測(cè)靈敏度不夠，且受檢測(cè)人員主觀判定影響較大，nugent評(píng)分方法雖然標(biāo)準(zhǔn)化程度更高，但是需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行顯微鏡檢查和計(jì)數(shù)，操作相對(duì)繁瑣，且由于僅能對(duì)部分的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，導(dǎo)致存在中間態(tài)的判定結(jié)果。

3、隨著近年來分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子診斷可對(duì)種(屬)進(jìn)行精確的識(shí)別，通過計(jì)算微生物的相對(duì)豐度來評(píng)估群落狀態(tài)類型(conmmunity?state?type,cst)，該方法可以提供更全面的陰道菌群信息，包括那些難以培養(yǎng)或常規(guī)方法難以檢測(cè)的細(xì)菌，有助于理解bv的微生物學(xué)基礎(chǔ)。缺點(diǎn)是16s?rdna費(fèi)用較高，需要專業(yè)的生物信息學(xué)分析，因此難以在臨床診斷上普及。以往大多數(shù)研究中使用的多數(shù)為單重pcr，如陰道加德納菌或陰道阿托波菌進(jìn)行檢測(cè)，但是往往存在較低的特異性問題，即使是多重pcr也會(huì)受到儀器的熒光通道數(shù)量的限制，需要對(duì)同一樣本進(jìn)行多次檢測(cè)，不僅需要大量的核酸，也耗費(fèi)較高的成本。

4、cn102770559b公開了一種診斷細(xì)菌性陰道炎的方法，分析患者測(cè)試樣本中是否存在一種或多種乳酸桿菌以及兩種或兩種以上的病原生物?？梢岳门c每一種目標(biāo)生物體相對(duì)應(yīng)的核酸片段的pcr分析，來檢測(cè)是否存在一種或多種乳酸桿菌以及兩種或兩種以上的病原生物。接著，所述目標(biāo)生物體的量可以用來確定指示細(xì)菌性陰道炎的診斷的分?jǐn)?shù)。

5、因此，亟需提供一種準(zhǔn)確性高，特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)單高效低成本的檢測(cè)細(xì)菌性陰道病的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和實(shí)際需求，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的引物、方法及應(yīng)用，能夠特異性檢測(cè)陰道阿托波菌、陰道加德納菌、巨球菌1型、細(xì)菌性陰道炎相關(guān)細(xì)菌bvab-2、卷曲乳桿菌和惰性乳桿菌。

2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的引物組，所述引物組的核酸序列包括如seq?id?no.1-seq?id?no.12所示的序列。

4、本發(fā)明中通過設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行超多重pcr擴(kuò)增富集，基于基因測(cè)序平臺(tái)的序列讀取獲得每種病原的檢測(cè)數(shù)據(jù)量，并通過機(jī)器學(xué)習(xí)模型的輔助，提供了一種用于評(píng)估細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的引物組和方法，可以解決現(xiàn)有的amsel和nugent評(píng)分方法主觀因素影響大，多重qpcr聯(lián)合檢測(cè)樣本量要求較高，16s?rdna檢測(cè)成本高等問題。

5、seq?id?no.1：ggttaataccggatactccatatt。

6、seq?id?no.2：ccgtgtctcagtcccaatct。

7、seq?id?no.3：gtgacatggtgctaatccct。

8、seq?id?no.4：gctgcccactttcatgactt。

9、seq?id?no.5：gatgccaacagtatccgtccg。

10、seq?id?no.6：cctctccgacactcaagttcga。

11、seq?id?no.7：caaaggaattgacggggacc。

12、seq?id?no.8：aattcagtctcctgaatcgtcaga。

13、seq?id?no.9：aactaacagatttacttcggtaatga。

14、seq?id?no.10：agctgatcatgcgatctgc。

15、seq?id?no.11：agtctgccttgaagatcgg。

16、seq?id?no.12：cttttaaacagttgataggcatcatc。

17、本發(fā)明中內(nèi)參包括：人基因組保守基因actb，用于監(jiān)測(cè)采樣和檢測(cè)過程是否合格。

18、本發(fā)明中擴(kuò)增所述人內(nèi)參基因actb的特異性引物序列包括seq?id?no.13和seqid?no.14所述的核酸序列。

19、seq?id?no.13：gccaccagaagaggtag。

20、seq?id?no.14：aatctggcaccacaccttc。

21、優(yōu)選地，所述細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原包括陰道阿托波菌、陰道加德納菌、巨球菌1型、細(xì)菌性陰道炎相關(guān)細(xì)菌bvab-2、卷曲乳桿菌或惰性乳桿菌中任意一種或至少兩種的組合。

22、第二方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的用于檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的引物組在制備用于檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

23、第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的試劑盒，所述試劑盒包括第一方面所述的用于檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的引物組。

24、第四方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的用于檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的引物組在檢測(cè)細(xì)菌性陰道病病原中的應(yīng)用。

25、第五方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的裝置，所述裝置包括：超多重pcr擴(kuò)增模塊、高通量測(cè)序和質(zhì)控模塊和模型構(gòu)建模塊；

26、所述超多重pcr擴(kuò)增模塊用于執(zhí)行包括：從待測(cè)樣本中提取dna作為模版，利用第一方面所述的用于檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的引物組進(jìn)行超多重pcr擴(kuò)增得到超多重pcr文庫；

27、所述高通量測(cè)序和質(zhì)控模塊用于執(zhí)行包括：對(duì)超多重pcr文庫進(jìn)行高通量測(cè)序和質(zhì)控，將質(zhì)控合格的待測(cè)樣本reads數(shù)均一化，得到病原均一化reads數(shù)矩陣；

28、所述模型構(gòu)建模塊用于執(zhí)行包括：通過機(jī)器學(xué)習(xí)模型預(yù)測(cè)細(xì)菌性陰道炎檢測(cè)的結(jié)果。

29、優(yōu)選地，所述待測(cè)樣本包括陰道分泌物。

30、優(yōu)選地，所述質(zhì)控合格的標(biāo)準(zhǔn)為每例待測(cè)樣本的測(cè)序總reads數(shù)≥20k、q30占比≥75％，內(nèi)參均一化reads數(shù)≥50；所述q30占比指的是在所有測(cè)序生成的堿基中，至少有75％的堿基達(dá)到了q30的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，所述內(nèi)參均一化reads數(shù)＝比對(duì)到內(nèi)參的reads數(shù)/樣本測(cè)序數(shù)據(jù)總reads數(shù)×100000。

31、優(yōu)選地，所述機(jī)器學(xué)習(xí)模型包括支持向量機(jī)模型、隨機(jī)森林模型或決策樹模型中任意一種。

32、優(yōu)選地，所述機(jī)器學(xué)習(xí)模型的輸入量為待檢測(cè)樣本生成的細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的均一化reads數(shù)矩陣，輸出量為每例待測(cè)樣本的細(xì)菌性陰道炎陰性或陽性預(yù)判結(jié)果，所述細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原包括陰道阿托波菌、陰道加德納菌、巨球菌1型、細(xì)菌性陰道炎相關(guān)細(xì)菌bvab-2、卷曲乳桿菌或惰性乳桿菌中任意一種或至少兩種的組合。

33、第六方面，本發(fā)明提供了一種針對(duì)超多重pcr擴(kuò)增的細(xì)菌性陰道炎的診斷模型的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

34、(1)針對(duì)細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原設(shè)計(jì)特異性引物，所述細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原包括陰道阿托波菌、陰道加德納菌、巨球菌1型、細(xì)菌性陰道炎相關(guān)細(xì)菌bvab-2、卷曲乳桿菌或惰性乳桿菌中任意一種或至少兩種的組合，所述特異性引物包括如seq?id?no.1-seq?idno.12所示的序列；

35、(2)針對(duì)特異性引物序列5’端設(shè)置公共序列，公共序列與illumina平臺(tái)的測(cè)序接頭3’端互補(bǔ)，針對(duì)每條測(cè)序接頭引物3’端設(shè)置公共序列互補(bǔ)序列；

36、(3)特異性引物與擴(kuò)增酶配制形成試劑體系1，對(duì)提取的待測(cè)樣本dna進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域超多重pcr擴(kuò)增；

37、(4)目標(biāo)區(qū)域片段進(jìn)行磁珠純化后再用測(cè)序接頭引物擴(kuò)增，測(cè)序接頭引物與擴(kuò)增酶配制形成文庫擴(kuò)增試劑體系2，進(jìn)行文庫擴(kuò)增，最終獲得文庫結(jié)構(gòu)為“illumina測(cè)序接頭-公共序列-目標(biāo)區(qū)域-公共序列-illumina測(cè)序接頭”；

38、(5)對(duì)每個(gè)超多重pcr文庫進(jìn)行磁珠純化，純化后將各文庫混合，獲得細(xì)菌性陰道炎檢測(cè)文庫；

39、(6)對(duì)步驟(5)得到的細(xì)菌性陰道炎檢測(cè)文庫進(jìn)行高通量測(cè)序，使用生物信息分析方法將測(cè)序的reads比對(duì)到自建基因組數(shù)據(jù)庫，獲取內(nèi)參和每種病原比對(duì)的reads數(shù)目，并進(jìn)行質(zhì)控判定，質(zhì)控合格的標(biāo)準(zhǔn)為每例待測(cè)樣本的測(cè)序總reads數(shù)≥20k、q30占比≥75％，內(nèi)參均一化reads數(shù)≥50；所述q30占比指的是在所有測(cè)序生成的堿基中，至少有75％的堿基達(dá)到了q30的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中q30為測(cè)序錯(cuò)誤率指標(biāo)，所述內(nèi)參均一化reads數(shù)＝比對(duì)到內(nèi)參的reads數(shù)/樣本測(cè)序數(shù)據(jù)總reads數(shù)×100000；

40、(7)對(duì)于質(zhì)控合格的樣本，首先通過生物信息統(tǒng)計(jì)分析，獲得所有比對(duì)到病原微生物的reads數(shù)，然后根據(jù)最大最小值均一化公式，對(duì)于所有待測(cè)樣本的每種病原進(jìn)行均一化處理，生成待測(cè)樣本對(duì)應(yīng)的病原均一化reads數(shù)矩陣，其中最大最小值均一化是將所有病原的reads數(shù)目轉(zhuǎn)換成0-1之間的值，視為病原之間的相對(duì)豐度，所述均一化公式如下：假定病原的reads數(shù)目為一個(gè)列表x_list，現(xiàn)給定一個(gè)病原reads數(shù)x，則均一化x’＝(x-min(x_list))/(max(x_list)-min(x_list))，公式中min(x_list)表示獲取列表x_list中的最小值，max(x_list)表示獲取列表x_list中的最大值；

41、(8)通過一批以nugent和amsel校正的細(xì)菌性陰道炎陰性和陽性結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，按照步驟(1)-步驟(7)進(jìn)行操作，以檢測(cè)的病原均一化reads數(shù)矩陣為特征值，分別輸入到支持向量機(jī)、隨機(jī)森林和決策樹機(jī)器學(xué)習(xí)模型訓(xùn)練，根據(jù)測(cè)試集樣本結(jié)果，選擇預(yù)測(cè)性能最佳的模型作為最終模型用于細(xì)菌性陰道炎的預(yù)測(cè)分析，選擇校正之后已知細(xì)菌性陰道炎陰性和陽性的測(cè)試集樣本為參考，通過已經(jīng)訓(xùn)練的機(jī)器學(xué)習(xí)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，分別計(jì)算不同模型的靈敏度和特異度值，最后依據(jù)約登指數(shù)，選擇分析性能最優(yōu)的預(yù)測(cè)模型，其中，約登指數(shù)的計(jì)算公式為：約登指數(shù)＝靈敏度+特異度-1。

42、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

43、(1)本發(fā)明通過對(duì)靶標(biāo)設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行超多重pcr擴(kuò)增富集提高檢測(cè)靈敏度，基于基因測(cè)序平臺(tái)(illumina)的序列讀取獲得每種病原的檢測(cè)數(shù)據(jù)量，并通過機(jī)器學(xué)習(xí)(mechine?learning,ml)模型的輔助，提供了一種用于評(píng)估細(xì)菌性陰道炎相關(guān)病原的引物組和方法，可以解決現(xiàn)有的amsel和nugent評(píng)分方法主觀因素影響大，多重qpcr聯(lián)合檢測(cè)存在樣本量要求較高，16s?rdna檢測(cè)成本高等問題；

44、(2)本發(fā)明中檢測(cè)樣本可直接利用臨床常規(guī)陰道微生態(tài)檢測(cè)樣本，無需額外采樣，構(gòu)建的檢測(cè)體系搭配預(yù)測(cè)模型對(duì)bv的預(yù)測(cè)具有無創(chuàng)、靈敏度高、準(zhǔn)確客觀等多種優(yōu)點(diǎn)。