本發(fā)明涉及細胞，具體地說，涉及一種修復(fù)損傷胰島β細胞的方法、產(chǎn)品與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、糖尿病是一種復(fù)雜的代謝性疾病，其核心特征是高血糖。這種高血糖狀態(tài)源于胰島素的分泌缺陷或其生物功能受損，長期的高血糖狀態(tài)會對多種器官和組織造成慢性損害，進而引發(fā)功能障礙。胰島素由胰島β細胞分泌。無論是1型糖尿病還是2型糖尿病，都存在胰島β細胞功能衰竭的問題。兩者的區(qū)別在于，1型糖尿病在發(fā)病初期就需要外源性胰島素來維持生命，而2型糖尿病的β細胞功能衰竭則通常發(fā)生在疾病的晚期。

2、因此，修復(fù)損傷胰島β細胞功能一直是醫(yī)學界和糖尿病患者追求的目標。目前人們寄希望于細胞外囊泡來達到這一目標，囊泡治療為代表的糖尿病治療替代策略被廣泛研究。其中間充質(zhì)干細胞細胞外囊泡療法是研究的重點領(lǐng)域之一，目前多集中于使用某種間充質(zhì)干細胞的細胞外囊泡修復(fù)胰島β細胞損傷。

3、細胞外囊泡（ev）是由原核生物、高等真核生物細胞釋放的一種囊泡，在生物的整個進化過程中是保守的。細胞外囊泡按照產(chǎn)生機制分為三種，分別是外泌體（exo）、微囊泡（mv）和凋亡小體，三者在囊泡直徑方面有一定的區(qū)別。由于它們的尺寸有重疊，因此區(qū)分外泌體和其他細胞外囊泡存在一定的挑戰(zhàn)。為了方便研究和描述，通常使用“sev”（小細胞外囊泡）和“l(fā)ev”（大細胞外囊泡）來指代不同尺寸的細胞外囊泡。

4、間充質(zhì)干細胞（msc）是一種功能強大的多能干細胞，具備多重優(yōu)勢。其來源廣泛且數(shù)量充足，使得獲取變得相對容易。此外，msc的分離、培養(yǎng)、擴增和純化過程也相對簡便，大大提高了其在臨床應(yīng)用的可行性。更為重要的是，msc的使用不涉及倫理學爭議，且不會引起免疫排斥反應(yīng)，這為其在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了極大的便利。msc自身具備的免疫調(diào)節(jié)功能，使其在治療多種疾病時展現(xiàn)出獨特的療效。目前，臨床已經(jīng)證實msc能夠有效治療心腦血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、肝腎損傷以及腦和脊髓神經(jīng)損傷等復(fù)雜病癥。這種細胞的強大修復(fù)能力，使得其在組織工程和再生醫(yī)學領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

5、liquiritigenin（甘草素，lq）是從甘草中分離出來的一種黃酮，具有細胞保護、抗炎和抗腫瘤等特性。此外，lq是一種植物提取的雌激素受體?β?激動劑，有報道稱它是一種抗糖尿病藥物，對鏈脲佐菌素（stz）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠有降血糖作用。

6、在糖尿病長期治療過程中，需要大量藥物治療，過高的劑量容易對身體產(chǎn)生不利的影響，且其中很多藥物都有毒性，對人體應(yīng)用的影響未知；使用間充質(zhì)干細胞細胞外囊泡治療糖尿病步驟普遍繁瑣，體外培養(yǎng)收集周期長，且獲得量低，不適合廣泛應(yīng)用于臨床；目前細胞外囊泡（ev）用于修復(fù)損傷的效率低，仍是使用大量藥物來治療，ev用于修復(fù)處于探索階段，還不能滿足臨床需要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種新的高效修復(fù)胰島β細胞的方法。

2、本發(fā)明提供一種非疾病診斷或治療目的的修復(fù)損傷胰島β細胞的方法，其使用sev和甘草素聯(lián)用進行損傷胰島β細胞的修復(fù)。

3、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)sev和甘草素在修復(fù)損傷胰島β細胞中存在協(xié)同作用，僅使用甘草素對于胰島β細胞的修復(fù)效果有限，但當將其與sev共同使用時，卻能使sev原本的修復(fù)效率得到進一步提升，實現(xiàn)了sev介導(dǎo)高效細胞間通訊損傷修復(fù)。與傳統(tǒng)的細胞外囊泡療法相比，本發(fā)明只用了一種無毒且成本低廉的化學小分子（甘草素已證實對人體有諸多益處，是一種藥用產(chǎn)品）與sev聯(lián)用，即提升了胰島β細胞的修復(fù)效率和水平，大大降低了治療成本，而且更加安全高效。

4、本發(fā)明的方法可應(yīng)用于胰島β細胞損傷機理研究、胰島β細胞損傷治療產(chǎn)品開發(fā)，藥物藥效評價等非疾病診斷或治療目的。

5、本發(fā)明的方法中，在胰島β細胞損傷的同時加入甘草素進行處理，之后在胰島β細胞損傷后再加入sev進行處理。

6、本發(fā)明的方法中，所述甘草素的工作濃度為5-10μm，sev的工作濃度為25-50μg/ml。

7、本發(fā)明的方法中優(yōu)選，所述甘草素的工作濃度為5μm，sev的工作濃度為25μg/ml。

8、本發(fā)明的方法中，所述甘草素處理的時間為24h，sev處理的時間為48h。

9、本發(fā)明的方法中，所述sev為具修復(fù)功能的干細胞所產(chǎn)生的小細胞外囊泡；sev的粒徑范圍為75-250nm。

10、優(yōu)選，所述干細胞為間充質(zhì)干細胞，更優(yōu)選為人源胎盤間充質(zhì)干細胞。

11、本發(fā)明的方法中，以所述干細胞生產(chǎn)小細胞外囊泡時，培養(yǎng)體系中的血清為無細胞外囊泡的血清。

12、作為一個具體實施方案，本發(fā)明提供的修復(fù)損傷胰島β細胞的方法，可包括：單獨修復(fù)和聯(lián)合修復(fù)；所述單獨修復(fù)sev工作濃度為1.56-50μg/ml，工作時間為24-72h；所述聯(lián)合修復(fù)中，sev工作濃度為25μg/ml，工作時間為48h，甘草素工作濃度為1-10μm。

13、具體修復(fù)時，可包括：將ins-1細胞鋪板后，待細胞匯合30%-50%時，加入棕櫚酸工作濃度為0.5mm的損傷體系、甘草素工作濃度為5μm的保護體系，培養(yǎng)24h，之后加入sev工作濃度為25μg/ml的培養(yǎng)體系，每24h更換一次sev培養(yǎng)體系，共培養(yǎng)48h。

14、在本發(fā)明提供的方法中，為了保證良好的修復(fù)效率，ins-1細胞培養(yǎng)體系中，采用無ev的血清。

15、在本發(fā)明提供的方法中，所述sev來自人源胎盤間充質(zhì)干細胞（hpmsc），人源胎盤間充質(zhì)干細胞（hpmsc）培養(yǎng)體系中，采用無ev的血清；分離得到sev的粒徑范圍為75nm-250nm。本發(fā)明應(yīng)用的pmsc是目前公認的研究細胞外囊泡修復(fù)疾病的細胞。

16、在本發(fā)明提供的方法中，在獲得sev時，所用方法具體如下：培養(yǎng)人源胎盤間充質(zhì)干細胞（hpmsc），每48h收集一次培養(yǎng)基，300g、2000g離心去除死細胞和細胞碎片，12000g離心去除大細胞外囊泡沉淀，120000g超速離心去除上清獲得沉淀，加入pbs重懸沉淀后再120000g超速離心一次，去除上清用pbs重懸沉淀，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

17、本發(fā)明還提供一種修復(fù)損傷胰島β細胞的產(chǎn)品，其包括具有修復(fù)功能的細胞所產(chǎn)生的小細胞外囊泡和甘草素。

18、本發(fā)明還提供上述產(chǎn)品在提高損傷胰島β細胞修復(fù)效率中的應(yīng)用。

19、本發(fā)明的有益效果至少在于：

20、本發(fā)明提供的方法可以更加高效和安全地修復(fù)損傷的胰島β細胞，用于后期糖尿病治療，以避免或解決單獨使用ev或甘草素帶來的效果差、價格昂貴等問題，并且，克服了傳統(tǒng)的干細胞療法存在的步驟繁瑣、修復(fù)時間太長、化學小分子毒性等問題，以及目前ev用于修復(fù)損傷效率太低的問題。

21、本發(fā)明提供的方法可用于在體外培養(yǎng)pmsc并收集其分泌的sev，然后將sev和甘草素聯(lián)合使用注射到患者體內(nèi)，不用依賴大量的sev和甘草素單獨治療。這種方法使治療費用大大降低，且沒有了免疫排異反應(yīng)。

技術(shù)特征：

1.一種非疾病診斷或治療目的的修復(fù)損傷胰島β細胞的方法，其特征在于，使用sev和甘草素聯(lián)用進行損傷胰島β細胞的修復(fù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在胰島β細胞損傷的同時加入甘草素進行處理，之后在胰島β細胞損傷后再加入sev進行處理。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述甘草素的工作濃度為5-10μm，sev的工作濃度為25-50μg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘草素的工作濃度為5μm，sev的工作濃度為25μg/ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項所述的方法，其特征在于，所述甘草素處理的時間為24h，sev處理的時間為48h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述sev為具修復(fù)功能的干細胞所產(chǎn)生的小細胞外囊泡；sev的粒徑范圍為75-250nm。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述干細胞為間充質(zhì)干細胞，優(yōu)選為人源胎盤間充質(zhì)干細胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，以所述干細胞生產(chǎn)小細胞外囊泡時，培養(yǎng)體系中的血清為無細胞外囊泡的血清。

9.一種修復(fù)損傷胰島β細胞的產(chǎn)品，其特征在于，包括具有修復(fù)功能的細胞所產(chǎn)生的小細胞外囊泡和甘草素。

10.權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品在提高損傷胰島β細胞修復(fù)效率中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及細胞技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種修復(fù)損傷胰島β細胞的方法、產(chǎn)品與應(yīng)用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)sEV和甘草素聯(lián)合使用可提升損傷胰島β細胞的修復(fù)效果，進而提出了一種非疾病診斷或治療目的的修復(fù)損傷胰島β細胞的方法，其使用sEV和甘草素聯(lián)用進行損傷胰島β細胞的修復(fù)。本發(fā)明提供的修復(fù)方法，僅用少量的甘草素與sEV即可產(chǎn)生協(xié)同作用進行修復(fù)，可作為一種sEV和藥物結(jié)合使用來治療糖尿病的新方式。本發(fā)明所提供的修復(fù)方法，修復(fù)效率高，有望將該修復(fù)損傷胰島β細胞的方式應(yīng)用于臨床。

技術(shù)研發(fā)人員：劉英輝,劉云鵬,王家濤,于海佳
受保護的技術(shù)使用者：南京師范大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9