本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種雙特異性抗體及其應用。

背景技術(shù)：

1、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(sars-cov-2)的出現(xiàn)對全球健康和社會經(jīng)濟造成了巨大損失。sars-cov-2迅速進化，經(jīng)歷了多個譜系和變種。基于原始病毒株開發(fā)的疫苗和抗體在應對新出現(xiàn)的變種方面的效力已經(jīng)減弱。此外，最近發(fā)現(xiàn)的幾種與sars相關(guān)的冠狀病毒(sarsr-covs)與sars-cov和sars-cov-2具有顯著的基因相似性，從而增加了它們向人類傳播的可能性。因此，提前準備應對不斷進化的sars-cov-2變種的策略是至關(guān)重要的。疫苗接種面臨與可及性和未解決的副作用相關(guān)的挑戰(zhàn)，這可能進一步影響其整體效力。迄今為止，令人擔憂的變種(vocs)的不斷出現(xiàn)對那些使用原始sars-cov-2病毒株序列(野生型)開發(fā)的疫苗提出了挑戰(zhàn)。例如，delta變種(b.1.617.2)及其傳播，主要歸因于其顯著逃避中和抗體的能力，這些抗體存在于康復和接種疫苗的人群中。omicron變種(ba.1)顯示出更高的突變傾向。隨后，出現(xiàn)了一系列omicron亞變種，其特點是在刺突(s)蛋白的受體結(jié)合域(rbd)中有一組突變。這些突變導致rbd的改變，可能會影響其與人體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(hace2)的結(jié)合親和力。值得注意的是，據(jù)報道，omicron?rbd與ace2的親和力較alpha或delta變種低。omicron的主要傳播因素是其增強的逃避多克隆抗體的能力，從而降低了血清抗體結(jié)合和中和的效力。

2、盡管單克隆抗體(mabs)在一定程度上證明了其廣譜中和活性和效力，被認為是對抗冠狀病毒的理想工具，但突變的不斷出現(xiàn)對現(xiàn)有的mabs提出了重大挑戰(zhàn)。雙特異性抗體(bsabs)是人工工程的抗體，能夠同時結(jié)合抗原的兩個表位或兩個不同的抗原。為了構(gòu)建具有廣譜中和活性的bsab，引入自然vh-ch1切換區(qū)域插入的支架是一種有前途的方法。已經(jīng)開發(fā)了幾種靶向sars-cov-2的bsabs形式，包括兩個免疫球蛋白g(igg)單鏈可變片段和與fc域融合的單鏈可變片段(scfvs)。盡管這些bsabs對假病毒和真實的vocs表現(xiàn)出增強的中和作用，但其效力的范圍仍然不足夠明確。然而，開發(fā)具有強中和活性和廣譜覆蓋的bsabs被認為是應對新出現(xiàn)變種的替代解決方案。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供一種雙特異性抗體及其應用，對sars-cov-2突變株和sars相關(guān)冠狀病毒具有廣譜中和活性。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包括第一抗原結(jié)合臂和第二抗原結(jié)合臂；所述第一抗原結(jié)合臂包括重鏈可變區(qū)vh1和輕鏈可變區(qū)vl1；所述第二抗原結(jié)合臂包括重鏈可變區(qū)vh2和輕鏈可變區(qū)vl2；所述vh1的氨基酸序列如seq?idno：1所示；所述vl1的氨基酸序列如seq?id?no：2所示；所述vh2的氨基酸序列如seq?id?no：3所示；所述vl2的氨基酸序列如seq?id?no：4所示。

4、本發(fā)明設(shè)計的雙特異性抗體的第一抗原結(jié)合臂選自其中一個母本抗體(該抗體可廣譜中和sars相關(guān)冠狀病毒)的重鏈可變區(qū)(h?chain?fv)序列seq?id?no：10：以及該母本抗體的輕鏈可變區(qū)(l?chain?fv)序列seq?id?no：11。

5、第二抗原結(jié)合臂選自另一個母本抗體(該抗體可廣譜中和sars-cov-2的變體)的重鏈可變區(qū)(h?chain?fv)序列：seq?id?no：12；以及該母本抗體的輕鏈可變區(qū)(l?chainfv)序列：seq?id?no：13。設(shè)計得到的雙特異性抗體第一結(jié)合臂針對sars-cov-2的rbd結(jié)合域，第二結(jié)合臂針對sars相關(guān)冠狀病毒的共享抗原表位。該特異性抗體通過同時結(jié)合兩種病毒的關(guān)鍵區(qū)域，從而提高中和能力，阻止病毒進入宿主細胞。

6、優(yōu)選地，所述雙特異性抗體的第一抗原結(jié)合臂特異性結(jié)合sars-cov-2的rbd受體結(jié)合域，第二抗原結(jié)合臂特異性結(jié)合sars相關(guān)冠狀病毒的共享抗原表位。

7、優(yōu)選地，所述雙特異性抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：5所示，輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：6所示。

8、優(yōu)選地，所述雙特異性抗體的重鏈氨基酸序列如seq?id?no：7所示，輕鏈氨基酸序列如seq?id?no：8所示。

9、優(yōu)選地，所述雙特異性抗體的重鏈可變區(qū)vh1和vh2、輕鏈可變區(qū)vl1和vl2分別通過gs?linker連接。

10、優(yōu)選地，gs?linker的氨基酸序列如seq?id?no：9所示。

11、優(yōu)選地，所述雙特異性抗體的制備方法包括如下步驟：

12、(a)設(shè)計包含第一抗原結(jié)合臂和第二抗原結(jié)合臂的雙特異性抗體的輕鏈和重鏈的核酸序列，通過gs?linker連接fv片段；

13、(b)將所述核酸序列插入表達載體中；

14、(c)將所述表達載體轉(zhuǎn)入293f細胞中；

15、(d)培養(yǎng)所述宿主細胞以表達所述雙特異性抗體；

16、(e)純化所述雙特異性抗體。

17、所述雙特異性抗體的構(gòu)建策略：構(gòu)建包含第一抗原結(jié)合臂和第二抗原結(jié)合臂的雙特異性抗體的輕鏈和重鏈，并將其插入表達載體pcdna3.1中，轉(zhuǎn)染hek293細胞，收集培養(yǎng)上清，使用protein?a柱進行純化。

18、第二方面，本發(fā)明提供了編碼上述雙特異性抗體的核酸分子。

19、第三方面，本發(fā)明提供了一種載體，所述載體包含上述核酸分子。

20、第四方面，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含上述核酸分子或上述載體。

21、優(yōu)選地，所述宿主細胞為293f細胞。

22、第五方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有上述的雙特異性抗體和藥學上可接受的載體。

23、第六方面，本發(fā)明提供了上述雙特異性抗體或所述雙特異性抗體的組合在制備預防和/或治療sars-cov-2突變株和/或sars相關(guān)冠狀病毒感染的藥物中的應用。

24、本發(fā)明所提供的雙特異性抗體表現(xiàn)出對s1的高結(jié)合能力，并對假病毒sars-cov-2變種(vocs)和與sars相關(guān)的冠狀病毒(sarsr-covs)具有廣譜和高效活性，表明本發(fā)明提供的雙特異性抗體具有防治sars-cov-2以及sars相關(guān)冠狀病毒潛力，可用于預防和/或治療sars-cov-2突變株和/或sars相關(guān)冠狀病毒感染。

25、本發(fā)明的有益之處在于：

26、本發(fā)明提供了一種對sars-cov-2突變株和sars相關(guān)冠狀病毒具有中和活性的雙特異性抗體，通過gs?linker將雙特異性抗體的單鏈可變片段融合，構(gòu)建了所述雙特異性抗體。該雙特異性抗體表現(xiàn)出對s1的高結(jié)合能力，并對假病毒sars-cov-2變種(vocs)和與sars相關(guān)的冠狀病毒(sarsr-covs)具有廣譜和高效活性，表明本發(fā)明提供的雙特異性抗體具有防治sars-cov-2以及sars相關(guān)冠狀病毒潛力。