本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)，具體涉及一種檢測netherton綜合征的試劑盒。

背景技術(shù)：

1、netherton綜合征（ns）是一種罕見的常染色體隱性疾病，由絲氨酸蛋白酶抑制劑kazal?5型（spink5）突變引起，發(fā)病率約為1/200000，其主要影響皮膚、頭發(fā)和免疫系統(tǒng)。spink5的突變導(dǎo)致淋巴上皮kazal型相關(guān)抑制劑（lekti）的缺失，從而導(dǎo)致絲氨酸蛋白酶活性不受限制，且會導(dǎo)致出現(xiàn)蛋白質(zhì)分解增加、角質(zhì)細(xì)胞的分解和脫落，最終破壞了皮膚的屏障功能。大多數(shù)ns患者在出生時或出生后不久便表現(xiàn)為全身性紅斑、鱗屑，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或匍行性的紅斑、鱗屑，在皮損邊緣呈特異的雙邊狀，因此也稱為迂回線狀魚鱗病。目前，根據(jù)報道，通過家族基因分析已發(fā)現(xiàn)有144個家族的80個spink5不同突變與netherton綜合征有關(guān)，包括c.81+2t>a、c.153delt、c.2368c>t等。

2、目前對于該類疾病的診斷，第一通過皮疹表現(xiàn)來判斷，容易誤診為特應(yīng)性皮炎；進(jìn)一步通過皮膚鏡觀察毛發(fā)改變，是否存在“竹節(jié)樣”改變；第三，通過皮膚病理檢查明確診斷，但該診斷需要切皮損，容易留下瘢痕，且病理特點(diǎn)無特異性；且由于該疾病為遺傳性疾病，因此明確該診斷，目前必須通過基因檢測手段。

3、因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域亟需解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測netherton綜合征的試劑盒。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種檢測netherton綜合征的引物對，其特征在于，包括正向引物和反向引物；

4、所述的正向引物為5‘-tggcaagacacatggcaata-3’?（seq?id?no.1）；

5、所述的反向引物為5‘-ggacagagtcagcatttcac-3’?（seq?id?no.2）。

6、本發(fā)明同時提供一種檢測netherton綜合征的試劑盒，該試劑盒包括上述引物對和pcr試劑。

7、進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述pcr試劑為premix?taq?。

8、進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述的pcr反應(yīng)體系為premix?taq??13μl，dna模版500ng，正向引物r?10μm?1μl，反向引物?10μm?1μl，ddh2o補(bǔ)至25μl，總體積25μl。

9、進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述的pcr反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃?10?s，55℃?30s，72℃?1min，38個循環(huán)；72℃延伸5min。

10、本發(fā)明提供一種檢測netherton綜合征的試劑盒，通過外周血進(jìn)行檢測，方便、快捷，具有特異性；本發(fā)明試劑盒主要用于明確netherton綜合征患者診斷，還可用于評估皮膚的屏障功能異?；颊?。使用本發(fā)明netherton綜合征的試劑盒對患者進(jìn)行檢測，若spink5外顯子26的第2475個堿基，由g突變成t，則表明其患有netherton綜合征。

11、目前申請人發(fā)現(xiàn)一例ns患者，收集家族血樣本，通過二代測序篩查，一代測序后發(fā)現(xiàn)spink5外顯子26?rs2303070（c.2475g>t），以前未見報道。因此我們將報道一例netherton綜合征患者新基因位點(diǎn)spink5外顯子26?rs2303070（c.2475g>t）。

12、本發(fā)明找到了spink5外顯子26?rs2303070（c.2475g>t）基因位點(diǎn)，為netherton綜合征患者提供的新的基因位點(diǎn)，皮膚屏障受損患者提供治療方案，從而為皮膚疾病的治療和護(hù)膚產(chǎn)品的研發(fā)提供新思路和方案。

13、本發(fā)明使用患者譜系的外周血進(jìn)行全外顯子組測序（wes）。wes顯示，患者spink5基因存在純合突變，即外顯子26僅在患者中是純合的，而在患者的父母中是雜合的，在患者的姐姐或哥哥中沒有突變。通過對患者家庭成員sanger測序分析，證實了該突變。采集患者家屬的血樣并進(jìn)行第二次測序。在外顯子26中鑒定出spink5中的單一純合突變（c.2475g>t；p.e825d），其導(dǎo)致氨基酸825處的glu變?yōu)閍sp（圖2）。

14、我們在netherton綜合征患者中發(fā)現(xiàn)spink5外顯子26?rs2303070（c.2475g>t），為臨床治療皮膚屏障受損疾病提供了新的基因位點(diǎn)，有待于皮膚屏障修復(fù)領(lǐng)域的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。

15、通過本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測，方便、快捷，具有特異性，本發(fā)明試劑盒不僅可以用于明確netherton綜合征患者診斷，還可用于評估皮膚的屏障功能異?；颊撸子谕茝V應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.一種檢測netherton綜合征的引物對，其特征在于，包括正向引物和反向引物；

2.一種檢測netherton綜合征的試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括如權(quán)利要求1所述的引物對和pcr試劑。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的netherton綜合征的試劑盒，其特征在于：所述pcr試劑為premix?taq?。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的netherton綜合征的試劑盒，其特征在于：所述的pcr反應(yīng)體系為premix?taq??13μl，dna模版500ng，正向引物r?10μm?1μl，反向引物?10μm?1μl，ddh2o補(bǔ)至25μl，總體積25μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的netherton綜合征的試劑盒，其特征在于：所述的pcr反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃?10?s，55℃?30?s，72℃?1min，38個循環(huán)；72℃延伸5min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種檢測Netherton綜合征的試劑盒，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括包括正向引物和反向引物；所述的正向引物為5‘?tggcaagacacatggcaata?3’；所述的反向引物為5‘?ggacagagtcagcatttcac?3’。通過本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測，方便、快捷，具有特異性，本發(fā)明試劑盒不僅可以用于明確Netherton綜合征患者診斷，還可用于評估皮膚的屏障功能異?；颊撸子谕茝V應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：涂穎,唐俊婷,孫東杰,秦宇梁
受保護(hù)的技術(shù)使用者：昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（云南省皮膚病醫(yī)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2