本發(fā)明屬于基因工程，具體為一種表達弓形蟲sag2a蛋白的重組干酪乳桿菌及其構(gòu)建方法和應用。

背景技術(shù)：

1、剛地弓形蟲(toxoplasma?gondii)是一種重要的機會致病原蟲，廣泛寄生于所有有核細胞中，人類和多種脊柱動物都可以作為其中間宿主，引起人獸共患的弓形蟲病(toxoplasmosis)。弓形蟲病主要分為兩大類，先天性和獲得性。先天性的弓形蟲病是懷孕婦女感染了弓形蟲后傳給嬰兒，導致出生的嬰兒患有腦積水、器官功能損傷、大腦鈣化等典型疾病甚至死亡。后天獲得性的弓形蟲病是指由外界感染而獲得的，常為隱性傳播，當宿主免疫功能正常時無明顯臨床癥狀，淋巴結(jié)腫大為主要臨床類型。當宿主免疫機能低下時，感染弓形蟲的癥狀將體現(xiàn)出來，表現(xiàn)為腦膜腦炎、精神異常和癲癇。弓形蟲不但可以感染人，同時也可以感染各種動物。當人食入生的或者未煮熟的含有被弓形蟲卵囊污染的動物制品時，則會感染弓形蟲，嚴重的危害人類的健康。

2、到目前為止，還沒有一種市售的疫苗可以完全預防弓形蟲病。唯一商業(yè)化的疫苗是s48弓形蟲速殖子減毒株由于該疫苗保質(zhì)期較短，生產(chǎn)成本也較高，且疫苗的安全性和成本效益也無法保障，導致目前僅用于羊弓形蟲病的預防。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種表達弓形蟲sag2a蛋白的重組干酪乳桿菌及構(gòu)建方法和應用，所述重組干酪乳桿菌對腸細胞具有良好的定植能力，增加脾細胞增殖活性，增加腸道特異性iga的分泌水平和血清中il-10的水平，可部分保護小鼠免受弓形蟲感染，該重組干酪乳桿菌在制備抗弓形病及其疫苗中具有廣闊的應用前景。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種表達弓形蟲sag2a蛋白的重組干酪乳桿菌，所述重組干酪乳桿菌含有重組表達載體ppg612.1-sag2a；所述重組表達載體的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

4、本發(fā)明還提供了一種所述的重組干酪乳桿菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：將重組表達載體ppg612.1-sag2a轉(zhuǎn)化至干酪乳桿菌感受態(tài)細胞，得到重組干酪乳桿菌。

5、優(yōu)選地，所述干酪乳桿菌感受態(tài)細胞為l.casei?393。

6、優(yōu)選地，所述重組表達載體ppg612.1-sag2a的構(gòu)建方法包括如下步驟：將弓形蟲sag2a基因連接至克隆載體peasy-t1?simple獲得重組載體peasy-t1simple-sag2a；將重組載體peasy-t1?simple-sag2a和乳酸菌表達載體ppg612.1進行雙酶切，獲得sag2a片段和ppg612.1載體片段；將所述sag2a片段和ppg612.1載體片段連接、轉(zhuǎn)化，獲得重組表達載體ppg612.1-sag2a。

7、優(yōu)選地，所述雙酶切的酶為限制性內(nèi)切酶bamhⅰ、ecorⅰ。

8、本發(fā)明還提供了一種所述重組干酪乳桿菌或所述構(gòu)建方法獲得的重組干酪乳桿菌在制備抗弓形蟲病藥物中的應用。

9、本發(fā)明還提供了一種所述重組干酪乳桿菌或所述構(gòu)建方法獲得的重組干酪乳桿菌在制備弓形蟲疫苗中的應用。

10、本發(fā)明還提供了一種抗弓形蟲病的藥物，所述藥物包括所述重組干酪乳桿菌或所述構(gòu)建方法獲得的重組干酪乳桿菌。

11、優(yōu)選地，所述藥物的劑型包括片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊劑或口服液。

12、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

13、本發(fā)明使用乳酸菌作為基因表達載體和交付系統(tǒng)，連接弓形蟲sag2a基因片段與乳酸ppg612.1載體片段乳酸菌分泌表達載體，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達弓形蟲sag2a蛋白的重組干酪乳桿菌。經(jīng)過試驗證實，sag2a基因可以穩(wěn)定遺傳，且sag2a蛋白可以在乳酸菌中成功表達。重組干酪乳桿菌可長期在小鼠腸道定植，分泌弓形蟲sag2a蛋白，提高小鼠腸道iga分泌水平，產(chǎn)生特異性sag2a蛋白抗體，增強黏膜免疫；增加脾細胞增殖活性，提高血清中il-10水平。小鼠口服免疫35天后的弓形蟲rh株攻擊實驗結(jié)果表明，重組干酪乳桿菌疫苗口服免疫可大大提高小鼠的存活率，提示重組干酪乳桿菌及其口服疫苗在防治弓形蟲病中具有巨大的潛力。本發(fā)明中干酪乳桿菌活載體疫苗在成本和安全性方面顯著優(yōu)于目前市場上現(xiàn)有的商業(yè)疫苗，這為實現(xiàn)廣泛普及和應用提供了強有力的經(jīng)濟支撐，在未來的疫苗市場中具有巨大的潛力和廣泛的應用前景。

14、本發(fā)明首次成功構(gòu)建了弓形蟲sag2a重組干酪乳桿菌，該重組干酪乳桿菌對腸細胞具有良好的定植能力，增加脾細胞增殖活性，增加腸道特異性iga的分泌水平和血清中il-10水平，可部分保護小鼠免受感染。本發(fā)明構(gòu)建獲得的重組干酪乳桿菌使用方式簡單、非侵入性(通過口腔或鼻內(nèi))、能接受基因修飾且遺傳穩(wěn)定、表達蛋白不需純化、成本低、安全性能最高、在體內(nèi)存活并不斷表達外源蛋白、可產(chǎn)生較為持久的免疫應答。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的疫苗效力計算方法計算得出弓形蟲sag2a重組干酪乳桿菌疫苗的疫苗效力為62.5％，已超過世界衛(wèi)生組織規(guī)定的50％，在商業(yè)疫苗中具有廣泛的應用前景。

技術(shù)特征：

1.一種表達弓形蟲sag2a蛋白的重組干酪乳桿菌，其特征在于，所述重組干酪乳桿菌含有重組表達載體ppg612.1-sag2a；所述重組表達載體的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

2.權(quán)利要求1所述的重組干酪乳桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：將重組表達載體ppg612.1-sag2a轉(zhuǎn)化至干酪乳桿菌感受態(tài)細胞，得到重組干酪乳桿菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述干酪乳桿菌感受態(tài)細胞為l.casei?393。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組表達載體ppg612.1-sag2a的構(gòu)建方法包括如下步驟：將弓形蟲sag2a基因連接至克隆載體peasy-t1?simple獲得重組載體peasy-t1?simple-sag2a；將重組載體peasy-t1?simple-sag2a和乳酸菌表達載體ppg612.1進行雙酶切，獲得sag2a片段和ppg612.1載體片段；將所述sag2a片段和ppg612.1載體片段連接、轉(zhuǎn)化，獲得重組表達載體ppg612.1-sag2a。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述雙酶切的酶為限制性內(nèi)切酶bamhⅰ、ecorⅰ。

6.權(quán)利要求1所述重組干酪乳桿菌或權(quán)利要求2-5任意一項所述構(gòu)建方法獲得的重組干酪乳桿菌在制備抗弓形蟲病藥物中的應用。

7.權(quán)利要求1所述重組干酪乳桿菌或權(quán)利要求2-5任意一項所述構(gòu)建方法獲得的重組干酪乳桿菌在制備弓形蟲疫苗中的應用。

8.一種抗弓形蟲病的藥物，其特征在于，所述藥物包括權(quán)利要求1所述重組干酪乳桿菌或權(quán)利要求2-5任意一項所述構(gòu)建方法獲得的重組干酪乳桿菌。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物，其特征在于，所述藥物的劑型包括片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊劑或口服液。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種表達弓形蟲SAG2A蛋白的重組干酪乳桿菌及其構(gòu)建方法和應用，涉及基因工程技術(shù)領域。本發(fā)明通過連接弓形蟲SAG2A基因片段與乳酸pPG612.1載體片段乳酸菌分泌表達載體，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達弓形蟲SAG2A蛋白的重組干酪乳桿菌。實驗證實，SAG2A基因可以穩(wěn)定遺傳，該蛋白可以在重組干酪乳桿菌中成功表達。重組干酪乳桿菌可長期在小鼠腸道定植，分泌弓形蟲SAG2A蛋白，提高小鼠腸道IgA分泌水平，產(chǎn)生特異性SAG2A蛋白抗體，增強黏膜免疫；增加脾細胞增殖活性，提高血清中IL?10水平。提示重組干酪乳桿菌在抗弓形蟲病中具有巨大的潛力。

技術(shù)研發(fā)人員：金春梅,賈芮,李亭玉,李寧宇,于龍政,付延軍,李鋼,汲生威
受保護的技術(shù)使用者：延邊大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30