本發(fā)明涉及化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及農(nóng)藥殘留檢測(cè)試劑，特別是指一種用于丁酰膽堿酯酶檢測(cè)的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、農(nóng)藥殘留是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中最敏感的話題之一。農(nóng)藥殘留通過(guò)食物鏈在人體中積累，是導(dǎo)致癌癥、動(dòng)脈硬化、心血管病、胎兒畸形、死胎、早夭、早衰等疾病的重要原因，嚴(yán)重威脅人類健康。以有機(jī)磷類農(nóng)藥為例，其可通過(guò)食用和呼吸系統(tǒng)、皮膚等渠道進(jìn)入人體并進(jìn)行傳播。一旦有機(jī)磷類農(nóng)藥進(jìn)入人體后，會(huì)遏制體內(nèi)原有活性物質(zhì)的活性，導(dǎo)致人體內(nèi)膽堿酯酶的含量下降，造成人體機(jī)能不可逆損傷。當(dāng)人體內(nèi)有機(jī)磷含量超過(guò)可承受范圍，便會(huì)出現(xiàn)肌肉痙攣、虛汗以及心跳加速等癥狀。若是未能及時(shí)對(duì)病情加以控制，會(huì)引起人體神經(jīng)系統(tǒng)部分功能喪失，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生紊亂。新修訂的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(gb?2763－2021)規(guī)定了564種農(nóng)藥在376種(類)食品中10092項(xiàng)最大殘留限量，標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量首次突破1萬(wàn)項(xiàng)，達(dá)到國(guó)際食品法典委員會(huì)(cac)的近2倍，更大范圍保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，確保老百姓“舌尖上的安全”。

2、傳統(tǒng)檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥的方法主要有色譜法、電化學(xué)法、毛細(xì)管電泳法、流動(dòng)注射分光光度分析、離子遷移譜等。上述方法雖然在靈敏度、穩(wěn)定性和檢測(cè)效率上各具優(yōu)勢(shì)，但存在儀器操作要求高、復(fù)雜的樣品制備過(guò)程及昂貴的儀器設(shè)備等弊端，因此有必要開(kāi)發(fā)出快捷、高效、低成本的農(nóng)藥檢測(cè)技術(shù)，在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、醫(yī)學(xué)科學(xué)以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面都具有重要的意義?？焖贆z測(cè)技術(shù)有利于樣品的快速篩查，但是目前食品以及農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)技術(shù)尚處于定性或半定量階段，在定量方面準(zhǔn)確度不高。因此發(fā)展痕量農(nóng)藥殘留的快速定量檢測(cè)技術(shù)具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。

3、基于有機(jī)小分子的熒光探針檢測(cè)方法具有選擇性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速、可以實(shí)時(shí)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。熒光探針本質(zhì)上是一種將分子間的微觀相互作用轉(zhuǎn)換為易為分析儀器識(shí)別的光學(xué)信號(hào)的工具。當(dāng)熒光探針與特定的目標(biāo)分析物發(fā)生相互作用后，體系熒光信號(hào)發(fā)生明顯的變化從而達(dá)到對(duì)特定目標(biāo)分析物的精準(zhǔn)檢測(cè)。熒光探針?lè)ㄒ驯粡V泛用于環(huán)境、生物體內(nèi)分析物的檢測(cè)與分析中。

4、由于多種農(nóng)藥發(fā)揮作用的機(jī)制是通過(guò)抑制有害生物中多種酶的活性，所以通過(guò)使用羧酸酯酶(carboxylesterases,cess)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,ache)、丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase，bche)等作為農(nóng)藥的識(shí)別原件檢測(cè)食品與環(huán)境水樣中農(nóng)藥殘留?；谟袡C(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶抑制作用的酶抑制法具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，已成為快速速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的常用方法。然而，已報(bào)道的絕大多數(shù)基于酶抑制法的熒光探針存在受硫醇干擾嚴(yán)重、靈敏度低、操作繁瑣等缺點(diǎn)。專利cn111592504a公開(kāi)了一種用于檢測(cè)丁酰膽堿酯酶活性的熒光探針及其合成方法與應(yīng)用，該探針的結(jié)構(gòu)式為將特定的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)丙基丁酸酯引入非發(fā)射骨架上，以產(chǎn)生bche靶標(biāo)受體p1，從而排除了探針本身的固有熒光。同時(shí)引入bche后，可以特異性切除環(huán)丙基丁酸，并進(jìn)行自發(fā)環(huán)化反應(yīng)，生成的熒光產(chǎn)物可以指示bche的活性；該探針的檢測(cè)限為0.092μg/ml。因此，開(kāi)發(fā)基于酶抑制劑法的抗干擾性強(qiáng)、靈敏度高的熒光探針并應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的快速準(zhǔn)確檢測(cè)是本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種用于丁酰膽堿酯酶檢測(cè)的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種用于丁酰膽堿酯酶高效檢測(cè)的熒光探針?lè)肿?，并將熒光探針技術(shù)與酶抑制法進(jìn)行整合，用于農(nóng)藥殘留的準(zhǔn)確檢測(cè)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

3、一種用于丁酰膽堿酯酶檢測(cè)的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如下：

4、

5、上述的用于丁酰膽堿酯酶檢測(cè)的熒光探針的制備方法，合成路線為：

6、

7、上述的用于丁酰膽堿酯酶檢測(cè)的熒光探針的制備方法，步驟如下：

8、(1)將1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物和對(duì)羥基苯甲醛溶解于乙醇中，回流反應(yīng)后，將反應(yīng)液濃縮，得到橙色化合物，即中間體cyn-oh；

9、(2)將中間體cyn-oh和三乙胺溶解于無(wú)水二氯甲烷溶劑中，0℃條件下滴加含有環(huán)丙基甲酰氯的無(wú)水二氯甲烷溶液后，室溫反應(yīng)，飽和食鹽水洗滌三次，有機(jī)相經(jīng)干燥、抽濾、濃縮、柱層析純化得黃色固體產(chǎn)物，即為用于丁酰膽堿酯酶檢測(cè)的熒光探針。

10、上述步驟(1)中1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物和對(duì)羥基苯甲醛的摩爾比為1:(0.8-4)。

11、上述步驟(1)中回流反應(yīng)的溫度為80-95℃，時(shí)間為12-36h；中間體cyn-oh的產(chǎn)率為65-85％。

12、上述步驟(2)中間體cyn-oh、三乙胺與環(huán)丙基甲酰氯的摩爾比為1:(1-10):(1-8)。

13、上述步驟(2)中室溫反應(yīng)的時(shí)間為8-24h。

14、上述步驟(2)中柱層析純化采用的洗脫液是體積比為(25-60):1的二氯甲烷和甲醇混合液；熒光探針cyn的產(chǎn)率為55-75％。

15、上述的熒光探針在檢測(cè)丁酰膽堿酯酶活性中的應(yīng)用。

16、進(jìn)一步，檢測(cè)丁酰膽堿酯酶活性中的應(yīng)用，包括如下步驟：將所述熒光探針加入到待測(cè)樣品中，進(jìn)行孵育使所述熒光探針與待測(cè)樣品中的丁酰膽堿酯酶反應(yīng)后脫去環(huán)丙甲?；鶊F(tuán)，生成中間體cyn-oh；隨后，進(jìn)行熒光檢測(cè)，所述熒光探針的發(fā)射峰的最大熒光強(qiáng)度與丁酰膽堿酯酶活性濃度成比例關(guān)系，能夠定量丁酰膽堿酯酶的活性。

17、上述孵育條件包括：溫度為30-40℃，ph值為6.5-9，時(shí)間為15-60min。例如，孵育條件中，溫度為30-35℃，ph值為6.5-7，時(shí)間為15-30min；孵育條件中，溫度為35-40℃，ph值為7-9，時(shí)間為30-60min；孵育條件中，溫度為32-40℃，ph值為7-9，時(shí)間為30-60min；孵育條件中，溫度為30，ph值為6.7，時(shí)間為40min；孵育條件中，溫度為34，ph值為7，時(shí)間為30min；孵育條件中，溫度為37，ph值為7.4，時(shí)間為20min；孵育條件中，溫度為40，ph值為9，時(shí)間為60min。

18、上述熒光檢測(cè)中，激發(fā)波長(zhǎng)為450-515nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520-700nm。例如，激發(fā)波長(zhǎng)為450-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520-600nm；激發(fā)波長(zhǎng)為500-515nm，發(fā)射波長(zhǎng)為600-700nm；激發(fā)波長(zhǎng)為510nm，發(fā)射波長(zhǎng)為550nm。

19、上述的熒光探針在檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。

20、進(jìn)一步，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用，具體步驟為：

21、(1)按照常規(guī)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥提取操作方法，進(jìn)行樣品提取，制備待測(cè)樣品提取液；取一定體積的待測(cè)樣品提取液作為待測(cè)試樣品溶液，加入酶試劑，然后加入熒光探針溶液，混合充分反應(yīng)后，進(jìn)行熒光檢測(cè)；反應(yīng)條件包括：溫度為37℃，ph值為7.42，時(shí)間為20min；熒光檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為510nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為555nm；所述酶試劑為丁酰膽堿酯酶。

22、(2)用檢測(cè)到的熒光信號(hào)換算抑制率(酶活性抑制率計(jì)算公式見(jiàn)式①)，再與農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比(y＝37.2x-41.4，r2＝0.999)，計(jì)算得到待測(cè)試樣品溶液的農(nóng)藥濃度。

23、

24、式中：r為抑制率(％)，f0為對(duì)照組相對(duì)熒光強(qiáng)度，f1為實(shí)驗(yàn)組相對(duì)熒光強(qiáng)度。

25、本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果是：

26、(1)本發(fā)明所述用于丁酰膽堿酯酶檢測(cè)的熒光探針制備方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高。分析測(cè)試結(jié)果表明該探針cyn對(duì)丁酰膽堿脂酶具有高效專一的選擇性，具有較強(qiáng)的抗干擾能力，其最低檢出限為0.0125μg/ml，ph適用范圍廣，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

27、(2)本發(fā)明的熒光探針cyn對(duì)丁酰膽堿酯酶的識(shí)別機(jī)理如下：

28、

29、通過(guò)高分辨質(zhì)譜進(jìn)行了確證，利用丁酰膽堿酯酶活性，探針識(shí)別丁酰膽堿酯酶后變?yōu)榫哂袕?qiáng)烈熒光的中間體cyn-oh，中間體cyn-oh的理論分子量為[c20h22no]+:292.1696(正離子模式加氫峰)，高分辨測(cè)試數(shù)據(jù)為292.1696(正離子模式)。高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)驗(yàn)證了本發(fā)明的熒光探針識(shí)別丁酰膽堿酯酶的識(shí)別機(jī)理，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更多的相關(guān)熒光探針提供了理論支撐。