本申請(qǐng)涉及分子生物學(xué)，尤其涉及一種細(xì)胞裂解上清液及制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)是一種體外表達(dá)蛋白的技術(shù)，利用mrna作為模板，通過(guò)加入細(xì)胞裂解上清液以及其他必須物質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)體外翻譯體系，完成蛋白質(zhì)的翻譯，實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)。在無(wú)內(nèi)在細(xì)胞代謝或生化途徑相沖突的情況下，膜蛋白、病毒蛋白和毒性蛋白以及通過(guò)細(xì)胞內(nèi)過(guò)程進(jìn)行快速蛋白水解的蛋白更容易表達(dá)。因此，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)可以作為一種較為理想的方法，用于合成傳統(tǒng)方式難以表達(dá)和進(jìn)行后續(xù)分析的蛋白質(zhì)。

2、在制作細(xì)胞裂解上清液的過(guò)程中，細(xì)胞不可避免的要進(jìn)行物理破碎或化學(xué)裂解等，這一過(guò)程會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)中影響蛋白質(zhì)翻譯的反應(yīng)之一就是eif2α磷酸化，磷酸化的eif2α占據(jù)eif2b與正常eif2α互相作用的位點(diǎn)，阻斷了eif2b介導(dǎo)的gdp與gtp的交換，阻止了翻譯起始復(fù)合物的形成，使細(xì)胞裂解上清液的翻譯活性降低。因此，降低或避免eif2α在細(xì)胞裂解上清液的制備過(guò)程中發(fā)生磷酸化反應(yīng)是亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本申請(qǐng)的目的在于提供一種細(xì)胞裂解上清液及制備方法與應(yīng)用，旨在解決細(xì)胞裂解上清液制備過(guò)程中eif2α磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞裂解上清液的翻譯活性降低的問(wèn)題。

2、本申請(qǐng)的技術(shù)方案如下：

3、本申請(qǐng)的第一方面，提供一種細(xì)胞裂解上清液，包括eif2α突變體和gadd34截短體；所述eif2α突變體為將eif2α第52位氨基酸進(jìn)行突變得到，所述gadd34截短體為將gadd34第1-240位氨基酸敲除得到。

4、可選地，所述eif2α突變體的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，所述eif2α突變體的編碼基因的核酸序列如seq?id?no.2所示。

5、可選地，所述gadd34截短體的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，所述gadd34截短體的編碼基因的核酸序列如seq?id?no.4所示。

6、本申請(qǐng)的第二方面，提供一種本申請(qǐng)第一方面的細(xì)胞裂解上清液的制備方法，包括步驟：獲得瞬時(shí)共表達(dá)eif2α突變體和gadd34截短體的細(xì)胞，加入緩沖液重懸，在冰浴環(huán)境中破碎細(xì)胞，離心，使細(xì)胞破碎物沉淀，得到所述細(xì)胞裂解上清液。

7、可選地，所述瞬時(shí)共表達(dá)eif2α突變體和gadd34截短體的細(xì)胞的制備方法，包括步驟：獲得gadd34截短體的重組表達(dá)質(zhì)粒和eif2α突變體的重組表達(dá)質(zhì)粒；將gadd34截短體的重組表達(dá)質(zhì)粒和eif2α突變體的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至同一哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得。

8、可選地，所述eif2α突變體的重組表達(dá)質(zhì)粒的制備方法包括步驟：以包含如seq?idno.5所示的核酸序列的基因片段為模板，利用第一引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到所述eif2α突變體的編碼基因；將所述eif2α突變體的編碼基因轉(zhuǎn)入質(zhì)粒中獲得所述eif2α突變體的重組表達(dá)質(zhì)粒。

9、可選地，所述第一引物對(duì)的核酸序列如seq?id?no.6和seq?id?no.7所示。

10、可選地，所述gadd34截短體的重組表達(dá)質(zhì)粒制備方法包括步驟：以野生型海拉細(xì)胞系的cdna文庫(kù)為模板，利用第二引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到所述gadd34截短體的編碼基因；將所述gadd34截短體的編碼基因轉(zhuǎn)入質(zhì)粒中獲得所述gadd34截短體的重組表達(dá)質(zhì)粒。

11、可選地，所述第二引物對(duì)的核酸序列如seq?id?no.8和seq?id?no.9所示。

12、本申請(qǐng)的第三方面，提供一種本申請(qǐng)第一方面的細(xì)胞裂解上清液在無(wú)細(xì)胞表達(dá)中的應(yīng)用。

13、本申請(qǐng)的有益效果：本申請(qǐng)的細(xì)胞裂解上清液中包括eif2α突變體和gadd34截短體，eif2α突變體是將eif2α第52位氨基酸進(jìn)行突變獲得，eif2α突變體與eif2α相比，不會(huì)受到磷酸化的影響，進(jìn)而不會(huì)降低細(xì)胞裂解上清液的翻譯活性；gadd34截短體是將gadd34第1-240位氨基酸敲除獲得，gadd34截短體的半衰期長(zhǎng)于gadd34，使gadd34截短體能夠延長(zhǎng)將磷酸化的翻譯起始因子去磷酸的效果，進(jìn)而提高細(xì)胞裂解上清液的翻譯活性。即包括eif2α突變體和gadd34截短體的細(xì)胞裂解上清液與正常的細(xì)胞裂解上清液相比，將可磷酸化的翻譯起始因子突變，將磷酸化的翻譯起始因子去磷酸化，保證細(xì)胞裂解上清液具有較高的翻譯活性。

技術(shù)特征：

1.一種細(xì)胞裂解上清液，其特征在于，包括eif2α突變體和gadd34截短體；所述eif2α突變體為將eif2α第52位氨基酸進(jìn)行突變得到,所述gadd34截短體為將gadd34第1-240位氨基酸敲除得到。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞裂解上清液，其特征在于，所述eif2α突變體的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，所述eif2α突變體的編碼基因的核酸序列如seq?id?no.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞裂解上清液，其特征在于，所述gadd34截短體的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，所述gadd34截短體的編碼基因的核酸序列如seq?id?no.4所示。

4.一種權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞裂解上清液的制備方法，其特征在于，包括步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞裂解上清液的制備方法，其特征在于，所述瞬時(shí)共表達(dá)eif2α突變體和gadd34截短體的細(xì)胞的制備方法，包括步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞裂解上清液的制備方法，其特征在于，所述eif2α突變體的重組表達(dá)質(zhì)粒的制備方法包括步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞裂解上清液的制備方法，其特征在于，所述第一引物對(duì)的核酸序列如seq?id?no.6和seq?id?no.7所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞裂解上清液的制備方法，其特征在于，所述gadd34截短體的重組表達(dá)質(zhì)粒制備方法包括步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞裂解上清液的制備方法，其特征在于，所述第二引物對(duì)的核酸序列如seq?id?no.8和seq?id?no.9所示。

10.一種權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞裂解上清液在無(wú)細(xì)胞表達(dá)中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體公開一種細(xì)胞裂解上清液及制備方法與應(yīng)用。其中細(xì)胞裂解上清液包括eIF2α突變體和GADD34截短體；所述eIF2α突變體為將eIF2α第52位氨基酸進(jìn)行突變得到，所述GADD34截短體為將GADD34第1?240位氨基酸敲除得到。本申請(qǐng)的細(xì)胞裂解上清液與正常的細(xì)胞裂解上清液相比，將可磷酸化的翻譯起始因子突變避免其磷酸化，同時(shí)可以將磷酸化的翻譯起始因子去磷酸化，保證細(xì)胞裂解上清液具有較高的翻譯活性。

技術(shù)研發(fā)人員：曾福星,杜子朔,杜夢(mèng)譚
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南方科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6