本發(fā)明提供一種提高效率及擴(kuò)大編輯窗口的線粒體abe堿基編輯系統(tǒng)，涉及一種新的堿基編輯工具（e-stelad），用于實(shí)現(xiàn)線粒體基因組上a/t到g/c的編輯，且能夠提高編輯效率以及擴(kuò)寬了編輯窗口，屬于生物。

背景技術(shù)：

1、線粒體疾病通常是由線粒體dna?(mtdna)突變引起的，這種突變會(huì)損害能量代謝和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的其他方面，對潛在生物學(xué)的不完全理解以及細(xì)胞和動(dòng)物模型的缺乏阻礙了對線粒體疾病治療方法的發(fā)展。

2、因此需要將特定修飾引入mtdna的工具來建立模型并潛在地治療這些疾病。然而，線粒體dna?(mtdna)內(nèi)的堿基編輯工具的發(fā)展一直受到將rna運(yùn)輸?shù)骄€粒體的挑戰(zhàn)的阻礙，包括crispr介導(dǎo)的基因組編輯工具所需的引導(dǎo)rna。

3、最近，人們發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)菌毒素蛋白的ddda功能域-dddatox具有雙鏈dna脫氨基酶活性，通過與tela相連形成胞嘧啶堿基編輯器(ddcbe)，實(shí)現(xiàn)線粒體中的c/g到t/a的突變。之后又通過與tada8e相連形成腺嘌呤堿基編輯器（stalad）,可以實(shí)現(xiàn)線粒體中的a/t到g/c的編輯。但是，原始版本的stelad的編輯效率較低以及靶向范圍窄，這大大限制了工具在構(gòu)建疾病模型上的應(yīng)用。因此開發(fā)突變效率更高，窗口更大的編輯器有助于人們對應(yīng)不同的突變位點(diǎn)、不同突變位置時(shí)有不同的選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于提供一種提高效率及擴(kuò)大編輯窗口的線粒體abe堿基編輯系統(tǒng),涉及一種新的堿基編輯工具（e-stelad），用于實(shí)現(xiàn)線粒體基因組上a/t到g/c的編輯，且能夠提高編輯效率以及擴(kuò)寬了編輯窗口。

2、本發(fā)明公開了一種提高效率及擴(kuò)大編輯窗口的線粒體abe堿基編輯系統(tǒng)，用于對動(dòng)物細(xì)胞器中的基因進(jìn)行編輯，包括線粒體定位信號（mts）、tela蛋白、half?dddatox（g1397n、g1397c）以及單鏈dna腺嘌呤脫氨酶tada8e，其中

3、所述mts包括sod2?mts和cox8?mts；該sod2?mts的核苷酸序列如seq?id?no.1；該cox8?mts的核苷酸序列如seq?id?no.2;

4、所述tela蛋白包括n端序列、特異性識別靶向序列的重復(fù)序列和c端序列;?n端序列的核苷酸序列如seq?id?no.3;?c端序列的核苷酸序列如seq?id?no.4;

5、所述的half?dddatox包括g1397n和g1397c；?g1397n的核苷酸序列如seq?id?no.5；g1397c的核苷酸序列如seq?id?no.6;?g1397n-q1310r-t1380i的核苷酸序列如seq?idno.7；g1397c-t1413i的核苷酸序列如seq?id?no.8；

6、所述的單鏈dna腺嘌呤脫氨酶tada8e的核苷酸序列如seq?id?no.9所示。

7、本發(fā)明所述的一種提高效率及擴(kuò)大編輯窗口的線粒體abe堿基編輯系統(tǒng)，其特征在于：相對于原始的stelad系統(tǒng)，該e-stelad系統(tǒng)具有更高的編輯效率以及更廣泛的編輯窗口（a1-a13）。

8、本發(fā)明所說的一種提高效率及擴(kuò)大編輯窗口的線粒體abe堿基編輯系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：

9、根據(jù)所述靶向序列，設(shè)計(jì)兩側(cè)的tela序列，按照half?dddatox的配對方式選擇融合雙鏈dna胞嘧啶脫氨基酶基因和單鏈dna腺嘌呤脫氨酶tada8e基因的載體；組裝完成的載體經(jīng)過sanger測序驗(yàn)證后，獲得正確組裝的融合載體；其中，

10、所述的half?dddatox的配對方式為g1397n和g1397c配對。

11、將正確組裝的融合載體按照half?dddatox的配對方式轉(zhuǎn)染n2a細(xì)胞，在三個(gè)n2a細(xì)胞位點(diǎn)（mt-co1，mt-rnr1，mt-nd1）驗(yàn)證了e-stelad的效率，相比stelad，e-stelad提高了編輯效率。

12、e-stelad系統(tǒng)窗口的表征，在3個(gè)位點(diǎn)評估了e-stelad的編輯活性，并表征編輯窗口為a1-a13。

13、在mt-nd5基因設(shè)計(jì)d393g突變，在胚胎水平上觀察到e-stelad成功編輯了第7位目標(biāo)a。

14、本發(fā)明的積極效果在于：提供了一種新的堿基編輯工具（e-stelad），具有增加基因組突變率以及擴(kuò)大編輯窗口的功能，可以用來探索線粒體dna突變的功能。同時(shí)，利用本發(fā)明的工具可對突變的dna進(jìn)行修復(fù)。能夠提高編輯效率以及擴(kuò)寬了編輯窗口，有助于人們對應(yīng)不同的突變位點(diǎn)、不同突變位置時(shí)有不同的選擇。

技術(shù)特征：

1.一種提高效率及擴(kuò)大編輯窗口的線粒體abe堿基編輯系統(tǒng)，其特征在于，用于對動(dòng)物線粒體細(xì)胞器中的基因編輯：

2.如權(quán)利要求1所述的一種提高效率及擴(kuò)大編輯窗口的線粒體abe堿基編輯系統(tǒng)，其特征在于：所述的half?dddatox，對其中的單個(gè)核苷酸進(jìn)行突變，用于提高原始蛋白的活性，該增強(qiáng)版的half?dddatox的核苷酸序列如下所示：

3.采用權(quán)利要求1所述構(gòu)建的一種提高效率及擴(kuò)大編輯窗口的線粒體abe堿基編輯系統(tǒng)，其特征在于：

4.如權(quán)利要求1所述的一種提高效率及擴(kuò)大編輯窗口的線粒體abe堿基編輯系統(tǒng)的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種提高效率及擴(kuò)大編輯窗口的線粒體ABE堿基編輯系統(tǒng)，提供了一種新的堿基編輯工具（E?sTELAD），具有增加基因組突變率以及擴(kuò)大編輯窗口的功能，可以用來探索線粒體DNA突變的功能。同時(shí)，利用本發(fā)明的工具可對突變的DNA進(jìn)行修復(fù)。能夠提高編輯效率以及擴(kuò)寬了編輯窗口，有助于人們對應(yīng)不同的突變位點(diǎn)、不同突變位置時(shí)有不同的選擇。

技術(shù)研發(fā)人員：李占軍,王迪,錢育強(qiáng),牛文超,趙丁,高汛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：吉林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2