一、本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，特別是一種基于磁分離的滾環(huán)擴(kuò)增超靈敏檢測(cè)gsk3β的方法。

背景技術(shù)：

0、二、背景技術(shù)

1、糖尿病腎臟疾病(dkd)是指由糖尿病所致的慢性腎臟疾病(ckd)，通常是根據(jù)尿白蛋白升高和/或估算的腎小球?yàn)V過(guò)率下降，同時(shí)排除其他ckd而做出的臨床診斷。dkd的臨床特征為逐漸進(jìn)展的蛋白尿、漸進(jìn)性腎功能下降，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重腎衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。單一的篩查指標(biāo)判斷腎臟是否存在損傷可能存在一些缺陷，因此臨床中應(yīng)結(jié)合多種輔助檢查方法來(lái)綜合判斷。同時(shí)應(yīng)該增強(qiáng)對(duì)糖尿病腎臟損傷的重視程度，規(guī)范對(duì)糖尿病腎臟損傷的評(píng)估，加強(qiáng)dkd的早期預(yù)測(cè)與診斷。

2、目前，臨床上dkd的診斷依賴于腎功能的評(píng)估，通常通過(guò)計(jì)算估計(jì)的腎小球?yàn)V過(guò)率(egfr)和對(duì)腎損傷進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估腎損傷通常通過(guò)檢查隨機(jī)尿樣中的尿白蛋白與肌酐比值。

3、使用egfr作為dkd早期診斷的標(biāo)志物存在一些潛在缺陷。首先，血清肌酐水平受肌肉質(zhì)量和飲食模式(尤其是肉類攝入量)的影響，可能會(huì)干擾egfr的計(jì)算。其次，在某些情況下，所使用的公式也可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。

4、白蛋白尿被認(rèn)為是腎損傷尤其是腎小球功能障礙的標(biāo)志物。通過(guò)檢查隨機(jī)尿樣中的白蛋白和肌酐水平來(lái)計(jì)算uacr是目前的臨床標(biāo)準(zhǔn)。然而，尿白蛋白排泄也可能因dkd以外的原因而增加，如體力活動(dòng)、飲食模式、感染、發(fā)熱、充血性心力衰竭、高血糖、月經(jīng)和高血壓。

5、在檢測(cè)早期dkd時(shí)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注使用尿白蛋白和肌酐以外的替代生物標(biāo)志物，包括尿液、血液和腎臟組織樣本中存在的基于蛋白質(zhì)的生物標(biāo)志物。

6、gsk3β(糖原合酶激酶3β)是一種高度保守的蘇氨酸/絲氨酸激酶，可激活糖原合酶。gsk3β作為葡萄糖代謝途徑的關(guān)鍵分子，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，在多種疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，也是指示dkd進(jìn)展的生物標(biāo)志物，研究表明，gsk3β的表達(dá)水平與腎臟損傷，尤其是糖尿病腎病腎臟損傷的程度成正相關(guān)，可作為糖尿病腎臟損傷的生物標(biāo)志物，但目前對(duì)于gsk3β在體液中的檢測(cè)方法，目前只有elisa法，且檢測(cè)的范圍有限。對(duì)于患者血清，尤其是尿液中g(shù)sk3β的表達(dá)水平較低的情況，elisa法檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)范圍明顯不足，且elisa法對(duì)于gsk3β的抗體依賴性較強(qiáng)，具有一定的局限性。因此，對(duì)于gsk3β檢測(cè)方法的改進(jìn)和創(chuàng)新是目前亟需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、三、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、針對(duì)上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種基于磁分離的滾環(huán)擴(kuò)增超靈敏檢測(cè)gsk3β的方法，可有效解決目前檢測(cè)患者體液中某蛋白質(zhì)表達(dá)的常用方法是elisa法，該方法的不足之處在于信號(hào)放大能力不足，檢測(cè)靈敏度有限的問(wèn)題。

2、本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，包括以下步驟：

3、1)制備抗體修飾磁珠

4、羧基修飾的磁珠與單抗抗體相連，磁分離去除未結(jié)合的單抗，得抗體修飾磁珠；

5、2)制備sh-dna修飾抗體

6、巰基修飾引物(sh-dna)與多抗抗體相連，通過(guò)12％?native-page電泳判斷反應(yīng)前后的dna的條帶位置驗(yàn)證dna與抗體的結(jié)合，得sh-dna修飾抗體；

7、3)滾環(huán)擴(kuò)增(rca)反應(yīng)

8、環(huán)模板通過(guò)磷酸和羥基未端的酶連接合成，通過(guò)模板介導(dǎo)的t4?dna連接酶連接成環(huán)，引物識(shí)別環(huán)模板的配對(duì)序列，在phi?29聚合酶的作用下合成重復(fù)線性單鏈dna/rna序列，包含重復(fù)的模板互補(bǔ)片段，rca反應(yīng)按照下列反應(yīng)體系混合試劑反應(yīng)20-60min，得rca產(chǎn)物；

9、反應(yīng)體系

10、

11、4)gsk3β蛋白檢測(cè)

12、用步驟1)制備的抗體修飾磁珠捕獲一定濃度梯度的gsk3β蛋白，磁分離并向磁珠沉淀加入步驟2)制備的sh-dna修飾抗體，磁分離并向磁珠沉淀中加入下列混合體系，磁分離后重懸加入步驟3)得到的rca產(chǎn)物；

13、混合體系

14、

15、

16、所述的環(huán)模板單鏈序列為:atacaataggactcaattctgctaacccgccctacccaatatcttcacctcgcatacagtccgggg，如seq?id?no.1所示。

17、所述的引物序列為：tcctattgtatccccggact，如seq?id?no.2所示。

18、所述的巰基修飾引物序列為：sh-tcctattgtatccccggact，如seq?id?no.3所示。

19、所述的rca產(chǎn)物為熒光互補(bǔ)寡核苷酸鏈，序列為：cy3-aacccgccctacccaatatc，如seq?id?no.4所示。

20、本發(fā)明所述的rca產(chǎn)物在制備檢測(cè)gsk3β蛋白試劑盒中的應(yīng)用。

21、本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)多重蛋白檢測(cè)，通過(guò)滾換擴(kuò)增的原理進(jìn)行患者標(biāo)本中g(shù)sk3β的超靈敏檢測(cè)，極大地提高了檢測(cè)靈敏度，可達(dá)fg級(jí)(fg/ml)；而市面上所使用的elisa檢測(cè)試劑盒，包括國(guó)外知名品牌如abcam,cell?signalling，invitrogen，均未達(dá)到ng/ml，且本發(fā)明方法可以使用多種檢測(cè)方式：如酶標(biāo)儀、激光共聚焦、流式，是檢測(cè)gsk3β的方法上的創(chuàng)新。

技術(shù)特征：

1.一種基于磁分離的滾環(huán)擴(kuò)增超靈敏檢測(cè)gsk3β的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁分離的滾環(huán)擴(kuò)增超靈敏檢測(cè)gsk3β的方法，其特征在于，所述的環(huán)模板單鏈序列為:atacaataggactcaattctgctaacccgccctacccaatatcttcacctcgcatacagtccgggg，如seq?id?no.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁分離的滾環(huán)擴(kuò)增超靈敏檢測(cè)gsk3β的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)方法得到的rca產(chǎn)物在制備檢測(cè)gsk3β蛋白試劑盒中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及基于磁分離的滾環(huán)擴(kuò)增超靈敏檢測(cè)GSK3β的方法，可有效解決目前檢測(cè)患者體液中某蛋白質(zhì)表達(dá)的常用方法是Elisa法，該方法的不足之處在于信號(hào)放大能力不足，檢測(cè)靈敏度有限的問(wèn)題，其解決的技術(shù)方案是，包括以下步驟：1)制備抗體修飾磁珠；2)制備SH?DNA修飾抗體；3)滾環(huán)擴(kuò)增RCA反應(yīng)；4)GSK3β蛋白檢測(cè)；本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)多重蛋白檢測(cè)，通過(guò)滾換擴(kuò)增的原理進(jìn)行患者標(biāo)本中GSK3β的超靈敏檢測(cè)，極大地提高了檢測(cè)靈敏度，可達(dá)fg級(jí)(fg/ml)；而市面上所使用的elisa檢測(cè)試劑盒，包括國(guó)外知名品牌如Abcam,cell?signalling，Invitrogen，均未達(dá)到ng/ml，且本發(fā)明方法可以使用多種檢測(cè)方式：如酶標(biāo)儀、激光共聚焦、流式，是檢測(cè)GSK3β的方法上的創(chuàng)新。

技術(shù)研發(fā)人員：郭佳,劉章鎖,張開(kāi)翔,王慧,厲研菲,張艷梅,燕禹帆,毛子慧,陳嶄
受保護(hù)的技術(shù)使用者：鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30