本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種基于crispr/cas9的car4基因示蹤動物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、本發(fā)明背景技術(shù)中公開的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、碳酸酐酶(carbonic?anhydrase，cas)是一種含鋅金屬酶，其主要功能是可逆催化二氧化碳的水合作用。人體中已發(fā)現(xiàn)15種同工酶，其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與組織分布各異。cas在調(diào)節(jié)細(xì)胞ph值、二氧化碳轉(zhuǎn)運、電解質(zhì)平衡和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等多種生理過程中發(fā)揮著重要的作用，對細(xì)胞的生存和增殖至關(guān)重要。目前，已有多種cas已成為眾多藥物研發(fā)的潛在靶點，cas抑制劑也已被用于治療高血壓，青光眼，水腫，肥胖和癲癇等疾病。

3、碳酸酐酶iv(carbonic?anhydrase?iv,ca4)是碳酸酐酶家族的一種同工酶，可以高效催化co2水化和hco3-的脫水反應(yīng)。研究者們陸續(xù)在大腦、心臟、肺、腎臟及肌肉等組織中發(fā)現(xiàn)了ca4的表達(dá)。但在不同的組織中，ca4的結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控均不盡相同。盡管來自肺和腎的ca4擁有相同的n末端氨基酸序列，但不同來源的ca4可在c端被不同程度地降解，或通過酰胺化或脫氨作用被進行不同程度的修飾。在甲狀腺激素受體α1(trα1)突變的小鼠模型中，肺和大腦中的ca4表達(dá)明顯減少，而腎臟ca4的表達(dá)量卻未受到trα1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)變化的影響。但腎臟中ca4的表達(dá)會受到甲狀腺激素的強烈抑制。在腎臟組織中，ca4主要存在于近曲小管和髓襻升支粗段上皮細(xì)胞的管腔面。不管呼吸性還是代謝性酸中毒時，近曲小管中的ca4表達(dá)和活性都會明顯增加，并通過促進h+分泌、加速酸性代謝產(chǎn)物的排出和hco3-的重吸收來酸化尿液。然而當(dāng)ca4表達(dá)受到抑制時，尿液中的ph值卻未受到影響。因此，在腎臟組織中當(dāng)ca4受到抑制時，其他ca可能起到了彌補作用。在肺組織中，ca4定位于肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮的管腔側(cè)，但在較大肺血管的內(nèi)皮中不存在。一項從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫下載的肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集進行生物分析得出的結(jié)果顯示，腫瘤組織中的ca4表達(dá)低于正常組織。在骨骼肌中，ca4已被發(fā)現(xiàn)位于質(zhì)膜和肌漿網(wǎng)膜上。單獨敲除ca4基因?qū)∪夤δ懿⑽串a(chǎn)生明顯影響，但ca4與ca14雙敲小鼠則顯示出肌肉功能降低。

4、研究證實ca4是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)大腦間質(zhì)ph的主要ca類型。除此之外，在gp70的參與下，ca4還可以非催化方式增強單羧酸轉(zhuǎn)運體2的轉(zhuǎn)運活性，加快神經(jīng)元對乳酸的吸收。但對于大腦組織中ca4表達(dá)的細(xì)胞類型，研究者們的觀點不一。svichar等人發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的ca4和ca14可以通過陰離子交換蛋白3介導(dǎo)的cl(-)-hco3(-)交換，在細(xì)胞內(nèi)ph的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。svichar等人證實，在星形膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)的ca4能夠催化腦細(xì)胞外液的緩沖。而ghandour等人發(fā)現(xiàn)，ca4僅在大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔表面上表達(dá)。這一結(jié)果除了提示ca4在大腦中co2和hco3-穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用外，還提示了ca4作為與血腦屏障相關(guān)的細(xì)胞生物標(biāo)記物的可能性。無獨有偶，盡管有研究發(fā)現(xiàn)在心肌肥厚的心衰患者心肌組織內(nèi)ca4的mrna水平升高。ca4在心臟組織內(nèi)的具體表達(dá)位置也尚存爭議。scheibe等人利用免疫組化技術(shù)在成年小鼠的心肌細(xì)胞中檢測到了ca4的表達(dá)。sender等人分別利用免疫組化和免疫電鏡及原位雜交技術(shù)證實在大鼠和人的心臟組織中，ca4在內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中均有表達(dá)。而knüppel-ruppert等研究人員則利用western?blot技術(shù)證實在人心臟組織中，ca4僅在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而心肌細(xì)胞中表達(dá)的則是另外一種ca。造成ca4在上述組織內(nèi)表達(dá)查一下的原因，究竟是ca4在不同時期的動物體內(nèi)的差異性表達(dá)，還是由于抗體或探針的特異性不足？因此，構(gòu)建ca4示蹤動物模型，不僅有助于明確ca4表達(dá)的時空性，亦有助于ca4陽性細(xì)胞的篩選及對其功能的研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于crispr/cas9的car4基因示蹤動物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。具體的，本發(fā)明通過crispr/cas9技術(shù)，采用示蹤基因插入的方式成功構(gòu)建ca4示蹤小鼠?；谏鲜鲅芯砍晒?，從而完成本發(fā)明。

2、具體的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明的第一個方面，提供一種基于crispr/cas9的car4基因示蹤動物模型的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括：

4、采用cas9對car4基因進行定點切割，然后使用同源定向修復(fù)(homology?directedrepair,hdr)的方法，將編碼熒光蛋白和creert2的外源基因整合至car4基因中，獲得f0代嵌合小鼠，將所述f0代嵌合小鼠與野生型小鼠雜交獲得穩(wěn)定的f1代小鼠，經(jīng)f1代小鼠自交，獲得純合子轉(zhuǎn)基因f2代小鼠即得。

5、其中，所述熒光蛋白可以為gfp、egfp和tdtomato；其中，egfp是優(yōu)選的。

6、更具體的，所述構(gòu)建方法包括：

7、將cas9?mrna、grna和供體dna重組質(zhì)粒的混合物導(dǎo)入小鼠的受精卵中，生成f0代嵌合小鼠；其中，所述供體dna重組質(zhì)粒至少包含p2a-egfp-t2a-creert2的編碼基因序列；本發(fā)明中，將egfp和creert2基因敲入到car4基因終止因子taa前面，產(chǎn)生受car4基因控制的egfp-creert2基因敲入小鼠，選擇自剪切多肽p2a對car4與egfp進行連接，使用t2a對egfp和creert2進行連接，2a肽的剪切效率高，使用2a肽作為連接元件，能夠?qū)崿F(xiàn)多蛋白的等量表達(dá)。

8、進一步的，在creert2后面加上起增強基因表達(dá)目的的wpre元件及在mrna的穩(wěn)定性、翻譯效率、細(xì)胞定位、多樣性以及細(xì)胞周期調(diào)控等多個方面發(fā)揮著重要作用的polya序列。

9、所述car4基因的外顯子8的靶序列如seq?id?no.1所示，所述grna的序列如seq?idno.2-3所示。從而使得上述外源基因能夠插入到car4基因的終止密碼子前面，位于該基因的增強子區(qū)域內(nèi)。進一步的，選取grna1(序列如seq?id?no.2所示)左側(cè)約1.5kb的序列，制備5’同源臂，選取grna2(序列如seq?id?no.3所示)右側(cè)約1.5kb的序列，制備3’同源臂。

10、所述小鼠為c57bl/6j小鼠。

11、進一步的，對f0代和f1代小鼠進行基因鑒定，挑選出序列正確的小鼠進行后續(xù)繁殖。

12、其中，對f0代小鼠進行基因鑒定的方法包括：分別在5’同源臂和3’同源臂的上下游設(shè)計引物，采用pcr的方法對基因重組后的f0代小鼠的基因進行鑒定；3’同源臂鑒定：在同源重組dna中應(yīng)擴增4.9kb片段，在陰性dna中可擴增8.8kb片段；5’同源臂鑒定：在同源重組dna中應(yīng)擴增出4.3kb的片段，而在陰性dna中不能擴增出任何片段。

13、對f1代小鼠進行基因鑒定的方法同f0代，即分別在5’同源臂和3’同源臂的上下游設(shè)計引物，采用pcr的方法對基因重組后的f1代小鼠的基因進行鑒定；3’同源臂鑒定：在同源重組dna中應(yīng)擴增4.9kb片段，在陰性dna中可擴增8.8kb片段；5’同源臂鑒定：在同源重組dna中應(yīng)擴增出4.3kb的片段，而在陰性dna中不能擴增出任何片段。

14、進一步的，純合子轉(zhuǎn)基因f2代小鼠的篩選方法為：分別在car4基因第八外顯子上下游設(shè)計引物，分別以car4基因和car4+egfp基因為模板，采用pcr擴增的方法對f2代小鼠的基因型進行鑒定，dna中僅能擴增出長度為385bp(p1p2＝385bp)的dna片段的為野生型小鼠，dna中能同時擴增出長度為385bp(p1p2＝385bp)和484bp(p1p4＝484bp)兩種片段的小鼠為car4+/-雜合子小鼠；dna中僅能擴增出長度為484bp(p1p4＝484bp)片段的小鼠為car4-/-純合小鼠。

15、本發(fā)明的第二個方面，提供上述構(gòu)建方法在如下任意一種或多種中的應(yīng)用：

16、(a)ca4蛋白表達(dá)譜研究；

17、(b)器官/組織內(nèi)ca4陽性細(xì)胞的篩選；

18、(c)實現(xiàn)組織內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中目的基因的條件性敲除。

19、其中，所述(c)中，所述組織可以是肺組織、腦組織和心肌組織。

20、更具體的，所述應(yīng)用(c)為：本發(fā)明構(gòu)建獲得car4基因示蹤動物小鼠模型通過與flox小鼠雜交進行上述組織內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中目的基因的條件性敲除。

21、上述一個或多個技術(shù)方案的有益技術(shù)效果：

22、上述技術(shù)方案通過基因插入的方式構(gòu)建了受car4基因控制的egfp-creert2基因敲入小鼠。該小鼠在表達(dá)ca4蛋白的同時，也表達(dá)egfp和雌激素受體的配體結(jié)合區(qū)突變體(ert)與cre重組酶的融合蛋白。熒光顯微鏡下，在car4-egfp-creert2小鼠的大腦、肺、腎臟及骨骼肌內(nèi)均檢測到了egfp信號。免疫組化結(jié)果顯示，在小鼠心肌組織內(nèi)ca4蛋白僅在心肌間毛細(xì)血管內(nèi)表達(dá)。與該結(jié)果一致的是，在car4-egfp-creert2小鼠的心肌間也檢測到了明顯的egfp熒光信號。western?blot結(jié)果顯示：與野生型小鼠相比，car4-egfp-creert2/+及car4-egfp-creert2小鼠心肌組織內(nèi)的ca4蛋白的表達(dá)并未出現(xiàn)明顯變化。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：與car4-egfp-creert2/+小鼠相比，從car4-egfp-creert2小鼠心肌組織內(nèi)皮細(xì)胞及ca4+內(nèi)皮細(xì)胞比例均無明顯變化。在上述基因敲入小鼠中，egfp可以很好地起到ca4蛋白示蹤的作用；egfp和creert2基因插入并未對心肌組織內(nèi)ca4表達(dá)及功能產(chǎn)生明顯影響；上述基因插入小鼠實現(xiàn)ca4蛋白示蹤的同時，也為實現(xiàn)心臟組織內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中目的基因的條件性敲除提供了一種可靠的cre工具鼠，因此具有良好的實際應(yīng)用之價值。