本發(fā)明涉及真菌抑制，尤其涉及一種利用甲基丙二酸抑制黃曲霉的方法。

背景技術(shù)：

1、花生是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)油料作物中種植面積居于第三位，種植面積廣，年產(chǎn)量一直居于世界首位，達(dá)到年產(chǎn)量1800萬(wàn)噸，占世界總產(chǎn)的40％。然而花生易受到黃曲霉(a.flavus)、寄生曲霉(a.parasiticus)等曲霉的侵染，產(chǎn)生的黃曲霉毒素具有劇毒性、致突變性、強(qiáng)致癌性，對(duì)人和動(dòng)物肝臟組織有強(qiáng)破壞作用，能夠誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌等疾病。我國(guó)花生黃曲霉毒素污染近年來(lái)總體呈加重趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅消費(fèi)安全、限制產(chǎn)業(yè)發(fā)展和出口貿(mào)易，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2、自然界中很多天然存在的微生物對(duì)黃曲霉菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒有抑制作用，包括乳酸桿菌、芽孢桿菌、假單胞菌，伯克氏菌屬等細(xì)菌和非產(chǎn)毒曲霉菌、木霉菌、黑曲霉、青霉菌等真菌。目前利用拮抗微生物進(jìn)行生物防控發(fā)展迅速，可以從田間源頭抑制黃曲霉等產(chǎn)毒菌生長(zhǎng)繁殖、降低產(chǎn)后花生黃曲霉毒素污染風(fēng)險(xiǎn)，且大多微生物還具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的作用，是安全高效、環(huán)境友好的阻控黃曲霉毒素污染的有效途徑。

3、黃曲霉菌的生物防控主要有三種模式：一種是拮抗物快速生長(zhǎng)，占領(lǐng)生態(tài)位，爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)和生存空間，從而替代病原體；另一種是抑制真菌生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)等，從而減少真菌的定植和感染；第三種是抑制黃曲霉毒素的生物合成。對(duì)于拮抗微生物而言，其代謝產(chǎn)物在抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒中起主要作用。

4、拮抗微生物的代謝產(chǎn)物在抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒中起主要作用，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約30種不同的化合物對(duì)產(chǎn)黃曲霉具有生物活性，但是抑制性化合物的種類仍然有限，主要包括脂肽、有機(jī)物、有機(jī)酸、抗生素和酶等，它們?cè)邳S曲霉的阻控中發(fā)揮著重要的作用，但仍然有大量未知的物質(zhì)還未發(fā)掘，其作用機(jī)制的研究也比較缺乏。

5、因此，探索和開(kāi)發(fā)新的黃曲霉抑制物質(zhì)，深入研究其作用機(jī)制，對(duì)于提升生物防控技術(shù)的效能，保障食品安全，促進(jìn)花生產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用甲基丙二酸抑制黃曲霉的方法。

2、本發(fā)明提供的利用甲基丙二酸抑制黃曲霉的方法包括如下步驟：

3、s1、對(duì)黃曲霉菌株進(jìn)行活化；

4、s2、準(zhǔn)備用于培養(yǎng)黃曲霉的培養(yǎng)基，包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基即pda培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基即pdb培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、最小鹽培養(yǎng)基、沙氏液體培養(yǎng)基；

5、s3、向pda培養(yǎng)基中接種解淀粉芽孢桿菌和黃曲霉孢子，探究解淀粉芽孢桿菌對(duì)黃曲霉的抑制效果；

6、s4、利用1640培養(yǎng)基接種黃曲霉菌，并添加解淀粉芽孢桿菌不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液，探究解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)黃曲霉的抑制效果；

7、s5、采用最小鹽培養(yǎng)基接種解淀粉芽孢桿菌，進(jìn)行非靶代謝組檢測(cè)；

8、s6、向pda培養(yǎng)基中分別添加甲基丙二酸、琥珀酸，并接種黃曲霉孢子，探究甲基丙二酸、琥珀酸對(duì)黃曲霉孢子的抑制效果；

9、s7、采用沙氏液體培養(yǎng)基并接種黃曲霉菌進(jìn)行培養(yǎng)，并利用高效液相色譜(hplc)對(duì)黃曲霉毒素afb1進(jìn)行測(cè)定，并使用電鏡對(duì)菌絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

10、優(yōu)選的，所述s1中，黃曲霉菌株的活化包括步驟：

11、吸取含25％甘油凍存的黃曲霉孢子液2ul于pda培養(yǎng)皿上，28℃，濕度90％，正置培養(yǎng)12h后，倒置培養(yǎng)4天(下同)，采用無(wú)菌0.01％吐溫80(121℃，20min)清洗孢子，最后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，孢子濃度為3.5×107cfu/ml(下同)。

12、優(yōu)選的，所述解淀粉芽孢桿菌的菌液濃度為od600＝1.0。

13、優(yōu)選的，所述s3的具體步驟為：

14、向pda培養(yǎng)基添加胰蛋白胨(5g/l)，并接種黃曲霉菌和解淀粉芽孢桿菌，接種量均為2ul，黃曲霉菌與解淀粉芽孢桿菌之間的間距為2cm，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)4天。

15、優(yōu)選的，所述s4中，培養(yǎng)基整體采用1640培養(yǎng)基，總體系為200ul，分成四組，分別添加10％lb肉湯培養(yǎng)基、10％1640培養(yǎng)基、10％解淀粉芽孢桿菌24h發(fā)酵液、10％解淀粉芽孢桿菌48h發(fā)酵液，lb肉湯培養(yǎng)基即為添加有酵母粉蛋白胨(5g/l)的pdb培養(yǎng)基。

16、優(yōu)選的，所述s4中，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件為：采用lb肉湯培養(yǎng)基，接種200ul解淀粉芽孢桿菌菌液，28℃，180r/min；

17、發(fā)酵液收集方法為：將發(fā)酵液倒入50ml無(wú)菌離心管中，5000r/min，10min，取上清過(guò)0.22um無(wú)菌濾膜。

18、優(yōu)選的，所述s5中，最小鹽培養(yǎng)基即為mm培養(yǎng)基，制作步驟為將0.5g葡萄糖、0.5g胰蛋白胨、0.5g谷氨酸鈉、0.5g酵母提取物、0.44g磷酸氫二甲、0.1g硫酸銨、0.1g硫酸鎂溶于1l純水中，并采用鹽酸和氫氧化鈉將培養(yǎng)液ph調(diào)整為7。

19、優(yōu)選的，所述s5的具體步驟為：向100mlmm培養(yǎng)基中接入200ul解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，分別在24h、48h取樣，即把發(fā)酵液倒入50ml無(wú)菌離心管中，5000r/min，10min，取上清于2mlep管中，立即放入液氮，-80℃凍存，進(jìn)行非靶代謝組檢測(cè)。

20、優(yōu)選的，所述s6具體步驟為：向pda培養(yǎng)基中分別添加甲基丙二酸、琥珀酸，添加量分別為5mm、10mm，121℃，20min，制備培養(yǎng)皿；取2ul黃曲霉孢子于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2天。

21、優(yōu)選的，所述s7中具體步驟為：

22、采用沙氏液體培養(yǎng)基，向其接種黃曲霉菌，最終工作濃度為3.5×103cfu/ml，28℃，180r/min，培養(yǎng)4天；

23、將上述沙氏液體培養(yǎng)的菌絲，采用四層無(wú)菌紗布過(guò)濾，收集到5ml凍存管中，-60℃真空冷凍干燥，稱取干重；

24、稱取10mg真空冷凍干燥的黃曲霉菌絲于1.5mlep管中，加入1ml80％甲醇(hplc級(jí)甲醇，ddh2o)，加入4顆直徑為3mm鋼珠，45hz研磨4min，接著10000r/min離心10min，取上清過(guò)0.22um有機(jī)膜，在使用80％甲醇稀釋10倍，利用高效液相色譜(hplc)對(duì)該樣品進(jìn)行測(cè)定；

25、再使用四層無(wú)菌紗布收集菌絲于3％戊二醛中，使用電鏡進(jìn)行觀察菌絲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并以同樣方式對(duì)添加甲基丙二酸的培養(yǎng)皿所培養(yǎng)的菌絲進(jìn)行電鏡觀察。

26、本發(fā)明提出的一種黃曲霉抑制劑或微生物菌劑，其有效成分包括甲基丙二酸。

27、優(yōu)選的，所述的黃曲霉抑制劑或微生物菌劑，有效成分包括產(chǎn)甲基丙二酸的微生物。

28、本發(fā)明還提出一種如上述的甲基丙二酸及產(chǎn)甲基丙二酸的微生物在農(nóng)作物生長(zhǎng)和儲(chǔ)存中抑制黃曲霉的生長(zhǎng)和黃曲霉毒素的生物合成中的應(yīng)用。

29、與相關(guān)技術(shù)相比較，本發(fā)明提供的利用甲基丙二酸抑制黃曲霉的方法具有如下有益效果：

30、本發(fā)明通過(guò)對(duì)顯著抑制黃曲酶生長(zhǎng)的解淀粉芽孢桿菌菌株發(fā)酵液進(jìn)行非靶向代謝組測(cè)序，了解了菌株產(chǎn)生的主要代謝物質(zhì)的類型，并發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)生大量的甲基丙二酸和琥珀酸等丙酸代謝通路的物質(zhì)，通過(guò)將二者加入到接種黃曲霉孢子的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(pda)或馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(pdb)中，發(fā)現(xiàn)甲基丙二酸能抑制黃曲霉的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)pdb中培養(yǎng)的黃曲霉進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)甲基丙二酸還顯著抑制黃曲霉的產(chǎn)毒，通過(guò)掃描及投射電鏡進(jìn)一步揭示甲基丙二酸能使黃曲霉菌絲皺縮，破壞細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)；

31、本發(fā)明闡述了甲基丙二酸具有黃曲霉及黃曲霉毒素的抑制能力，為黃曲霉的阻控提供了新的選擇性。