本發(fā)明屬于蜥蜴利什曼原蟲表達(dá)，具體涉及一種熒光利什曼原蟲質(zhì)粒、靶向巨噬細(xì)胞的spd-1蜥蜴利什曼原蟲表達(dá)系統(tǒng)及制備方法。

背景技術(shù)：

1、利什曼原蟲屬于錐蟲科(眼蟲動(dòng)物界，動(dòng)基體目)，特異性的識(shí)別并感染巨噬細(xì)胞，引起人類利什曼原蟲病。在眾多致病的蟲株中，蜥蜴利什曼原蟲為可使蜥蜴患病的對于人類來說是非致病性的利什曼原蟲，該蟲種可以特異性識(shí)別感染鼠和人的巨噬細(xì)胞，在不致病的同時(shí)，可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白。目前，蜥蜴利什曼原蟲真核表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功的表達(dá)了纖維蛋白溶酶原、紅細(xì)胞生成素、ifnγ、hiv-1gag蛋白、c反應(yīng)蛋白、hendra病毒吸附蛋白等蛋白。該系統(tǒng)表達(dá)的蛋白不僅與人類蛋白結(jié)構(gòu)相近，穩(wěn)定，易篩選；而且其前鞭毛體的生長周期短，繁殖快，易掌控，安全性好，可大量的表達(dá)目的蛋白。當(dāng)一種生物體進(jìn)入另外一種生物體中尤其是哺乳動(dòng)物，即使不治病，也會(huì)引起宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)，那么當(dāng)蜥蜴利什曼原蟲進(jìn)入機(jī)體和巨噬細(xì)胞內(nèi)，免疫系統(tǒng)也會(huì)發(fā)生一些變化。研究者通過腹腔途徑用蜥蜴利什曼原蟲感染balb/c小鼠,熒光定量pcr方法檢測發(fā)現(xiàn)蜥蜴利什曼原蟲可分布于balb/c小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟體，在感染13d內(nèi)，蜥蜴利什曼原蟲呈波浪狀增殖，且無感染后臨床癥狀。同時(shí)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性igg抗體，活化淋巴細(xì)胞，使ifn-γ、il-2增值，il10和il4等細(xì)胞因子沒有發(fā)生變化。眾所周知，ifn-γ、il-2在結(jié)核病的診斷和治療過程中均有非常重要的價(jià)值，尤其是針對耐藥結(jié)核病可以應(yīng)用ifn-γ、il-2等免疫制劑來提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)機(jī)體抗結(jié)核的能力，這些變化是有利于巨噬細(xì)胞抗胞內(nèi)結(jié)核桿菌的。因此，推測蜥蜴利什曼原蟲進(jìn)入巨噬細(xì)胞是可以發(fā)揮其預(yù)期作用的。

2、spd-1蛋白作為pd-1的一種可溶性版本，是阻斷pd-1/pd-l1通路的良好抑制劑，因其保留的pd-l1結(jié)合域，可以與pd-1競爭pd-l1的結(jié)合位點(diǎn)，所以可作為pd-1配體的阻斷劑發(fā)揮作用，抑制pd-1與pd-l1和pd-l2的相互作用以及pd-l1與b7-1(cd80)的相互作用。體外和體內(nèi)分析均表明，在免疫功能正常的卵巢癌小鼠模型中，高親和力spd-1分子可阻斷pd-l1和pd-l2介導(dǎo)的免疫逃逸并減少腫瘤生長。

3、spd-1還可以與其他蛋白或療法組合發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。例如，通過注射表達(dá)共刺激分子4-1bbl和spd-1的裸質(zhì)粒對小鼠h22?hcc異位腫瘤進(jìn)行局部治療，可根除小鼠腫瘤中少量預(yù)先接種的腫瘤細(xì)胞，并在大約60％的小鼠中根除大量預(yù)先接種的腫瘤細(xì)胞纖連蛋白ch50-spd-1重組肽可增加細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對腫瘤的細(xì)胞溶解活性。與單獨(dú)表達(dá)單純皰疹病毒胸苷激酶(hsvtk)的腺病毒相比，表達(dá)spd-1-ig的腺病毒顯著增強(qiáng)了cd8t細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤排斥反應(yīng)。

4、目前現(xiàn)有的利什曼原蟲質(zhì)粒，如plexsy?neo2.1，可以在任意一種利什曼原蟲中表達(dá)目的蛋白，但無法表達(dá)熒光，不利于觀察和篩選。而能夠表達(dá)熒光的質(zhì)粒，如plexsy_ie-blecherry系列質(zhì)粒，卻只能在特定的重組蜥蜴利什曼原蟲(lexsy?host?t7-tr)體內(nèi)表達(dá)熒光。

5、因此，目前急需一種可同時(shí)表達(dá)熒光蛋白和spd-1蛋白的蜥蜴利什曼原蟲表達(dá)系統(tǒng)，可以特異性識(shí)別人類、鼠類等巨噬細(xì)胞的蛋白表達(dá)載體，并可在胞內(nèi)充分表達(dá)spd-1這一抑癌蛋白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供一種蜥蜴利什曼原蟲表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)表達(dá)熒光蛋白和spd-1蛋白，并通過蜥蜴利什曼原蟲對巨噬細(xì)胞的靶向作用，胞內(nèi)表達(dá)spd-1蛋白，分析其誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)的變化，以期用一種新的方式表達(dá)和呈遞spd-1蛋白，為癌癥的治療提供新的思路和方法。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種熒光利什曼原蟲質(zhì)粒，所述質(zhì)粒由片段1和片段2首尾相接組成，所述片段1用于在各類利什曼原蟲中表達(dá)目的蛋白，片段2帶有櫻桃紅熒光蛋白和bleo抗性；

3、所述片段1的核苷酸序列如seq?id?no:1所示；所述片段2的核苷酸序列如seq?idno:2所示；質(zhì)粒為pln-mcherry，核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

4、進(jìn)一步的，所述片段1為pln，所述片段2為mcherry+bleo。

5、一種靶向巨噬細(xì)胞的spd-1蜥蜴利什曼原蟲表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌為蜥蜴利什曼原蟲，含有重組質(zhì)粒nc-spd-1，所述重組質(zhì)粒nc-spd-1由權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的質(zhì)粒及spd-1序列組成；

6、所述表達(dá)系統(tǒng)能夠在任一種利什曼原蟲中同時(shí)表達(dá)熒光蛋白和目的蛋白spd-1。

7、進(jìn)一步的，所述目的蛋白spd-1的核苷酸序列如seq?id?no:4示。

8、進(jìn)一步的，所述重組質(zhì)粒nc-spd-1的核苷酸序列如seq?id?no:5示。

9、靶向巨噬細(xì)胞的spd-1蜥蜴利什曼原蟲表達(dá)系統(tǒng)的制備方法，

10、(1)化學(xué)合成如seq?id?no:4所示的目的蛋白spd-1核苷酸序列；選擇sal?i、kpn?i兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)合成特異性的上下游引物，擴(kuò)增得到spd-1基因片段；

11、上游引物seq?id?no:6：gtggtgggtacctccacctccaga，

12、下游引物seq?id?no:7:cgtgtcggtcgacatgcaaattcca

13、(2)pcr擴(kuò)增后的spd-1基因片段與pln-mcherry連接，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒nc-spd-1；

14、(3)將重組質(zhì)粒nc-spd-1線性化；

15、(4)線性化載體電轉(zhuǎn)染蜥蜴利什曼原蟲

16、(5)篩選表達(dá)目的蛋白的蜥蜴利什曼原蟲。

17、進(jìn)一步的，

18、所述(2)包括：

19、使用限制性內(nèi)切酶sal?i和kpn?i對pcr擴(kuò)增后的spd-1基因片段及pln-mcherry質(zhì)粒酶切，用1％的瓊脂糖凝膠80v，電泳25min，瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，將spd-1基因片段和線性化pln-mcherry載體進(jìn)行交換連接，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒nc-spd-1。

20、進(jìn)一步的，

21、所述(3)包括：

22、將重組質(zhì)粒nc-spd-1于37℃金屬浴反應(yīng)1h，加入1.5ml無水乙醇置于-20℃，30min，13000rpm，15min，棄上清，加入1ml75％乙醇，12000rpm，10min，棄上清，吸干管壁液體，室溫晾干，加50μl?ddh2o溶解，測定濃度，保存于-20℃。

23、進(jìn)一步的，

24、所述(4)包括：

25、取適量狀態(tài)活躍呈水滴狀的蜥蜴利什曼原蟲，3500rpm，5min，棄上清，bhi培養(yǎng)基和1％血紅素作空白對照，蟲體用bhi培養(yǎng)基和1％血紅素重懸為od600約為2.3的蟲液，在高壓過的1.5ml離心管管底加入10μg質(zhì)粒，加入870μl蟲液，吹打混勻，小心加入4mm電擊杯中，冰水浴10min；將電穿孔儀調(diào)為1500v，25μf，2pulse，10”interval，1.2ms的電擊模式，電擊后冰上放置10min，將電擊蟲體加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，孔內(nèi)補(bǔ)入適量bhi培養(yǎng)基和1％血紅素，26℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

26、進(jìn)一步的，

27、所述(5)包括：

28、電轉(zhuǎn)原蟲約24h后，向孔內(nèi)添加bleo抗生素篩選，電轉(zhuǎn)原蟲約48h后，于熒光顯微鏡下觀察蟲體狀態(tài)及熒光表達(dá)情況，可見游動(dòng)的紅色熒光物體并擴(kuò)大培養(yǎng)，得到spd-1蜥蜴利什曼原蟲表達(dá)系統(tǒng)。

29、本發(fā)明的有益之處：

30、本發(fā)明成功構(gòu)建pln-mcherry利什曼原蟲表達(dá)質(zhì)粒，并在蜥蜴利什曼原蟲中表達(dá)櫻桃紅熒光；成功獲得表達(dá)spd-1蜥蜴利什曼原蟲表達(dá)系統(tǒng)，可在任意一種利什曼原蟲中既表達(dá)熒光蛋白又表達(dá)目的蛋白，并且兩種蛋白的表達(dá)互不影響，所表達(dá)的目的蛋白不僅與人類蛋白結(jié)構(gòu)相近，穩(wěn)定，易篩選；而且其前鞭毛體的生長周期短，繁殖快，易掌控，安全性好，可大量的表達(dá)目的蛋白，可靶向巨噬細(xì)胞表達(dá)spd-1蛋白，特異性識(shí)別感染鼠和人的巨噬細(xì)胞，在不致病的同時(shí)，可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白spd-1。