本申請涉及生物工程，尤其涉及一種過表達轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元分化的方法。

背景技術(shù)：

1、干細(xì)胞是具有分化成特定譜系能力的自我更新群體。人多能干細(xì)胞(humanpluripotent?stem?cells,hpscs)包括人胚胎干細(xì)胞(human?embryonic?stem?cells,hescs)以及2006年由山中伸彌利用四因子組合(myc，oct4，sox2和klf4)產(chǎn)生的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipscs)，它們提供了一種非常早期發(fā)育階段的人類細(xì)胞的可再生來源，有可能在成人體內(nèi)形成任何細(xì)胞類型。因此，人多能干細(xì)胞帶來了一個可擴展的細(xì)胞來源，可以從中獲得標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的細(xì)胞衍生物用于各種疾病的治療。

2、帕金森病(parkinson’s?disease,pd)是世界第二類進行性神經(jīng)退行性疾病，帕金森病的神經(jīng)病理學(xué)特征是位于黑質(zhì)致密部中多巴胺能神經(jīng)元的漸進性死亡與多巴胺水平的耗盡。因此，在帕金森病患者的單個局部大腦中替換多巴胺能神經(jīng)元有望緩解其缺陷。

3、現(xiàn)有技術(shù)中，人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)元的產(chǎn)生主要包括定向分化、和誘導(dǎo)分化。定向分化主要是通過利用外源因子(如重組蛋白或小分子)來刺激或拮抗已知在目標(biāo)細(xì)胞類型發(fā)育過程中很重要的信號通路，從而一步步實現(xiàn)干細(xì)胞到神經(jīng)元的發(fā)育過程。相比之下，使用基因工程技術(shù)來“開啟”神經(jīng)源性因子的表達，從而直接從干細(xì)胞產(chǎn)生有絲分裂后的神經(jīng)元，實現(xiàn)誘導(dǎo)分化。這一過程繞過或大大縮短了發(fā)育進程，并縮短了生成神經(jīng)元所需的時間。不僅誘導(dǎo)速度有益，而且無論是批次內(nèi)還是批次間，誘導(dǎo)的神經(jīng)元群往往比定向分化產(chǎn)生的神經(jīng)元群更加同質(zhì)。目前有關(guān)誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的方案有很多，但是這些方案所得的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量較少。因此，亟需提供一種高效的誘導(dǎo)方案，用于高通量藥物篩選，和潛在的細(xì)胞替代療法的細(xì)胞來源。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本申請?zhí)峁┮环N過表達轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元分化的方法、多巴胺能神經(jīng)元及其應(yīng)用，能夠解決現(xiàn)有技術(shù)中多巴胺能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化效率低下的問題。

2、第一方面，本申請?zhí)峁┮环N過表達轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，包括將轉(zhuǎn)錄因子引入人多能干細(xì)胞中過表達，經(jīng)培養(yǎng)得到多巴胺能神經(jīng)元的步驟，具體包括如下步驟：

3、(1)選擇誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄因子；

4、(2)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的病毒載體，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移；

5、(3)將步驟(2)的病毒載體感染人多能干細(xì)胞；

6、(4)多巴胺能神經(jīng)元鑒定；

7、上述轉(zhuǎn)錄因子包括ebf4，fosl1，meis2，yap1，nhp2，cdx2，pax7，znf415和ebf3。其中，ebf4的cdna序列如seq?id?no.1所示；fosl1的cdna序列如seq?id?no.2所示；meis2的cdna序列如seq?id?no.3所示；yap1的cdna序列如seq?id?no.4所示；nhp2的cdna序列如seqid?no.5所示；cdx2的cdna序列如seq?id?no.6所示；pax7的cdna序列如seq?id?no.7所示；znf415的cdna序列如seq?id?no.8所示；ebf3的cdna序列如seq?idno.9所示。

8、優(yōu)選地，上述步驟(2)的攜帶轉(zhuǎn)錄因子病毒載體為攜帶ebf4，fosl1，meis2，yap1，nhp2，cdx2，pax7，znf415和ebf3編碼基因的慢病毒載體。

9、優(yōu)選地，上述步驟(3)的病毒載體感染人多能干細(xì)胞通過如下方法：用構(gòu)建的攜帶轉(zhuǎn)錄因子的病毒感染人離體多能干細(xì)胞后，接種到細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

10、優(yōu)選地，上述步驟(4)的多巴胺能神經(jīng)元鑒定通過如下方法：經(jīng)免疫熒光染色法鑒定與多巴胺產(chǎn)生有關(guān)的酶。

11、優(yōu)選地，上述與多巴胺產(chǎn)生有關(guān)的酶包括酪氨酸羥化酶。

12、第二方面，本申請?zhí)峁┮环N采用上述的方法誘導(dǎo)得到的多巴胺能神經(jīng)元。

13、第三方面，本申請?zhí)峁┥鲜龆喟桶纺苌窠?jīng)元在開發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。

14、優(yōu)選地，上述應(yīng)用包括高通量法篩選轉(zhuǎn)錄因子、神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理模型的構(gòu)建、神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物篩選中的至少一種。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

16、基于本申請的過表達轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，通過向人多能干細(xì)胞引入特定的轉(zhuǎn)錄因子并過表達，采用流式分析檢測分化證實將10個轉(zhuǎn)錄因子同時過表達，能高效地誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的分化。提供了一種分化效率高的多巴胺能神經(jīng)元陽性率的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)方案。

17、基于本申請的過表達轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元分化方法培養(yǎng)得到的多巴胺能神經(jīng)元，可以用于采用高通量法篩選轉(zhuǎn)錄因子、神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理模型的構(gòu)建、神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物開發(fā)或神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物篩選，為帕金森病的后續(xù)研究提供了新的實驗基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種過表達轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，其特征在于，包括將轉(zhuǎn)錄因子引入人多能干細(xì)胞中過表達，經(jīng)培養(yǎng)得到多巴胺能神經(jīng)元的步驟，具體包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的攜帶轉(zhuǎn)錄因子病毒載體為攜帶ebf4，fosl1，meis2，yap1，nhp2，cdx2，pax7，znf415和ebf3編碼基因的慢病毒載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)的病毒載體感染人多能干細(xì)胞通過如下方法：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)的多巴胺能神經(jīng)元鑒定包括如下方法：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述與多巴胺產(chǎn)生有關(guān)的酶包括酪氨酸羥化酶。

6.一種多巴胺能神經(jīng)元，其特征在于，采用權(quán)利要求1～5任一項所述的方法誘導(dǎo)得到。

7.權(quán)利要求6所述的多巴胺能神經(jīng)元在開發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括高通量法篩選轉(zhuǎn)錄因子、神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理模型的構(gòu)建或神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物篩選中的至少一種。

技術(shù)總結(jié)
本申請公開了一種過表達轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，包括將轉(zhuǎn)錄因子引入人多能干細(xì)胞中過表達，經(jīng)培養(yǎng)得到多巴胺能神經(jīng)元的步驟。轉(zhuǎn)錄因子為EBF4，F(xiàn)OSL1，MEIS2，YAP1，NHP2，CDX2，PAX7，ZNF415和EBF3。流式分析檢測實驗證明，將10個轉(zhuǎn)錄因子同時過表達，能高效地誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的分化。本申請?zhí)峁┑倪^表達轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，分化效率高?；诒旧暾埖姆只椒ㄅ囵B(yǎng)得到的多巴胺能神經(jīng)元，可以用于高通量法篩選轉(zhuǎn)錄因子、神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理模型的構(gòu)建、神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物開發(fā)或神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物篩選，為帕金森病的后續(xù)研究提供了新的實驗基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：方芳,趙暖暖,夏尼諾
受保護的技術(shù)使用者：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2