本發(fā)明屬于生物，涉及一種抗cd4蛋白的抗體、其片段或融合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、cd4蛋白，也稱為cd4分子或cd4受體，是一種在t輔助細(xì)胞表面表達(dá)的主要表面糖蛋白。它在t細(xì)胞識別抗原、啟動免疫反應(yīng)的過程中扮演著關(guān)鍵角色。cd4分子通過與抗原呈遞細(xì)胞上的mhc?ii類分子結(jié)合，幫助t細(xì)胞識別并攻擊外來病原體，如病毒、細(xì)菌等。cd4蛋白，也稱為cd4分子或cd4受體，是一種在t輔助細(xì)胞表面表達(dá)的主要表面糖蛋白。它在t細(xì)胞識別抗原、啟動免疫反應(yīng)的過程中扮演著關(guān)鍵角色。cd4分子通過與抗原呈遞細(xì)胞上的mhc-ii類分子結(jié)合，幫助t細(xì)胞識別并攻擊外來病原體，如病毒、細(xì)菌等。cd4+t細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵角色，能夠識別由抗原呈遞細(xì)胞(apc)提呈的外來抗原并產(chǎn)生響應(yīng)。這種響應(yīng)可以調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞，如b細(xì)胞或cd8+t細(xì)胞的活動，也可以啟動新的免疫反應(yīng)。cd4+t細(xì)胞可以分化為多種效應(yīng)t細(xì)胞亞群，如th1、th2、th17和treg等，執(zhí)行不同的免疫功能。cd4+t細(xì)胞的活化和分化對免疫反應(yīng)的成功啟動至關(guān)重要。cd4抗體可以用于免疫組織化學(xué)、免疫印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫沉淀等技術(shù)來檢測cd4蛋白，在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中具有多種功能。此外，cd4抗體在細(xì)胞分選中發(fā)揮著重要作用，也可用于流式細(xì)胞術(shù)分析和細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、目前商品化的cd4抗體中，沒有一個(gè)抗體是足夠敏感和足夠特異，尤其在細(xì)胞表面cd4蛋白檢測和特異性細(xì)胞分選方面，存在非特異結(jié)合、抗體親和力差等原因?qū)е碌臋z測靈敏度不夠、分選效率低等。

2、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了以下的技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含seq?id?no：1所示的氨基酸序列的h-cdr1，包含seq?id?no：2所示的氨基酸序列的h-cdr2，和包含seq?id?no：3所示的氨基酸序列的h-cdr3，或其在h-cdr中包含多至3、2或1個(gè)氨基酸替換的變體；并且所述vl包含seq?id?no：4所示的氨基酸序列的l-cdr1，包含seq?id?no：5所示的氨基酸序列的l-cdr2，和包含seq?id?no：6所示的氨基酸序列的l-cdr3，或其在l-cdr中包含多至3、2或1個(gè)氨基酸替換的變體。

4、進(jìn)一步，所述抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白的cdr劃分是以kabat、imgt、chothia、abm或contact編號系統(tǒng)進(jìn)行。

5、進(jìn)一步，所述抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白的cdr劃分是以kabat編號系統(tǒng)進(jìn)行。

6、進(jìn)一步，所述重鏈可變區(qū)包含：seq?id?no：1、2和3所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3；所述輕鏈可變區(qū)包含：seq?id?no：4、seq?id?no:5和seq?idno:6所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3；

7、進(jìn)一步，所述重鏈可變區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)重鏈框架區(qū)hfr1、hfr2、hfr3和hfr4，和/或一個(gè)或多個(gè)輕鏈框架區(qū)lfr1、lfr2、lfr3和lfr4，所述重鏈框架區(qū)hfr1、hfr2、hfr3和hfr4分別具有與seq?id?no:7-10所示的氨基酸序列至少85％的序列同一性的同源序列，所述輕鏈框架區(qū)lfr1、lfr2、lfr3和lfr4分別具有與seq?id?no:11-14所示的氨基酸序列至少85％的序列同一性的同源序列；

8、進(jìn)一步，所述重鏈框架區(qū)hfr1、hfr2、hfr3和hfr4的氨基酸序列分別如seq?id?no:7-10所示，所述輕鏈框架區(qū)lfr1、lfr2、lfr3和lfr4的氨基酸序列分別如seq?id?no:11-14所示。

9、進(jìn)一步，所述重鏈可變區(qū)包含seq?id?no：15所示的氨基酸序列，或者與其具有至少85％的序列同一性的同源序列；所述輕鏈可變區(qū)包含seq?id?no：16所示的氨基酸序列，或者與其具有至少85％的序列同一性的同源序列；

10、進(jìn)一步，所述重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)(ch1恒定區(qū))包含seq?id?no:17所示的氨基酸序列，或者與其具有至少85％的序列同一性的同源序列；所述輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)包含seq?id?no:18所示的氨基酸序列，或者與其具有至少85％的序列同一性的同源序列。

11、進(jìn)一步，所述輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)即為輕鏈全長。

12、進(jìn)一步，所述重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)(ch1恒定區(qū))為抗體重鏈在fab片段(抗原結(jié)合片段)的部分。

13、在一些實(shí)施方案中，“序列同一性百分比”可通過以下來計(jì)算：對比窗口中的兩個(gè)最佳比對序列、確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(例如a、t、c、g、i)或相同氨基酸殘基(例如ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met)的位置數(shù)量以得到匹配位置的數(shù)量、將匹配位置的數(shù)量除以比較窗口中的位置總數(shù)(即窗口大小)，并且將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。

14、進(jìn)一步，其為雙鏈抗體、fab、fab'、f(ab')2、fd、fv片段、二硫鍵穩(wěn)定的fv片段、(dsfv)2、雙重特異性dsfv、二硫鍵穩(wěn)定的雙鏈抗體、單鏈抗體分子、scfv二聚體、多重特異性抗體、駱駝化單域抗體、納米抗體、域抗體或二價(jià)域抗體；

15、進(jìn)一步，所述抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白的來源是人或非人哺乳動物；

16、在一些實(shí)施方案中，所述非人哺乳動物是指除人以外的胎生動物，包括鼠、羊、兔、馬、牛、豬、狗、猴等。

17、進(jìn)一步，所述抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白的來源是鼠源。

18、進(jìn)一步，所述抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白還包括一個(gè)或多個(gè)不影響結(jié)合特異性的氨基酸殘基的替換或修飾。

19、在一些實(shí)施方案中，vh區(qū)(重鏈可變區(qū))和vl區(qū)(輕鏈可變區(qū))還可被細(xì)分為具有高變性的區(qū)域(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr))，其間散布有較保守的稱為構(gòu)架區(qū)(fr)的區(qū)域。各vh和vl由按下列順序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4從氨基末端至羧基末端排列的3個(gè)cdr和4個(gè)fr組成。各重鏈，輕鏈中的可變區(qū)(vh和vl)分別形成抗原結(jié)合部位。

20、本發(fā)明提供了一種核酸分子，所述核酸分子編碼前面所述的抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白。

21、進(jìn)一步，所述核酸分子包括dna、cdna、mrna、重組核酸。

22、進(jìn)一步，所述核酸分子的核苷酸序列是經(jīng)過密碼子優(yōu)化的。

23、在一些具體的實(shí)施方案中，所述核酸分子包括保守的核酸取代。所述保守的核酸取代是指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸分子不編碼氨基酸序列的情況下，基本相同或相關(guān)的序列。在一些具體的實(shí)施方案中，所述核酸分子應(yīng)用遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼大多數(shù)蛋白質(zhì)。

24、本發(fā)明提供了一種載體，其包含前面所述的核酸分子。

25、進(jìn)一步，所述載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒、質(zhì)粒。

26、在一些實(shí)施方案中，具體載體的選擇將取決于靶細(xì)胞和所處理的條件。

27、本發(fā)明提供了一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包括前面所述的核酸分子、和/或前面所述的載體。

28、進(jìn)一步，所述細(xì)胞包括真核細(xì)胞和原核細(xì)胞。

29、進(jìn)一步，所述原核細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞、大腸桿菌、鏈霉菌。

30、進(jìn)一步，所述真核細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞。

31、進(jìn)一步，所述哺乳動物細(xì)胞包括人、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、山羊、綿羊、牛、豬、犬、貓。

32、進(jìn)一步，所述真核細(xì)胞包括人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞、山羊細(xì)胞、綿羊細(xì)胞或任何其它細(xì)胞。

33、在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞還包括人工制備的細(xì)胞系。

34、本發(fā)明提供了如下任一種應(yīng)用：

35、1)前面所述的抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白，前面所述的核酸分子，前面所述的載體，或前面所述的細(xì)胞在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防由cd4蛋白引起的疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用；

36、2)前面所述的抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白，前面所述的核酸分子，前面所述的載體，或前面所述的細(xì)胞在生產(chǎn)用于檢測cd4蛋白的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

37、3)前面所述的抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白，前面所述的核酸分子，前面所述的載體，或前面所述的細(xì)胞在生產(chǎn)細(xì)胞分選產(chǎn)品中的應(yīng)用；

38、進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括試劑盒、試紙、核酸膜條、芯片、系統(tǒng)、或裝置。

39、進(jìn)一步，所述細(xì)胞分選包括流式細(xì)胞術(shù)或細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測中所使用的細(xì)胞分選。

40、本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括前面所述的抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白，前面所述的核酸分子，前面所述的載體，或前面所述的細(xì)胞；

41、進(jìn)一步，所述藥物組合物還包括藥學(xué)上可用的載體、稀釋劑、緩沖劑或賦形劑。

42、進(jìn)一步，所述藥物組合物在全身施用，具體通過鼻內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、腹腔內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑、皮內(nèi)途徑、皮下途徑、真皮下途徑、透皮途徑、顱內(nèi)途徑、粘膜途徑、肛門途徑、陰道途徑、口腔途徑、頰途徑或它們可以被吸入來遞送。

43、本發(fā)明提供了如下任一種方法：

44、1)表達(dá)前面所述的抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白的方法，所述方法包括使用前面所述的核酸分子、前面所述的載體或前面所述的細(xì)胞，表達(dá)出前面所述的抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白，最后分類提純得到產(chǎn)物；

45、2)檢測樣本中cd4蛋白的方法，所述方法包括將樣本與前面所述的抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白接觸的步驟；

46、3)細(xì)胞分選的方法，所述方法包括將前面所述的抗cd4蛋白抗體、其片段或融合蛋白與預(yù)分選細(xì)胞接觸，然后通過抗體的固定從而分離目的細(xì)胞。