本發(fā)明涉及基因工程，尤其涉及一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法。

背景技術(shù)：

1、流感是由流感病毒感染引起的一種嚴(yán)重的急性呼吸道傳染病。在全球范圍內(nèi)，每年因流感病毒感染可導(dǎo)致300-500萬重癥病例和29萬-65萬死亡病例。根據(jù)流感病毒核蛋白(np)和基質(zhì)蛋白(m)的抗原性不同，可將其分為甲、乙、丙、丁四個型。其中乙型流感病毒分為victoria和yamagata兩個譜系，主要感染人和少量哺乳動物，如海豹和豬。乙型流感病毒常在全球范圍內(nèi)與甲型流感病毒共流行，在流感的局部暴發(fā)或季節(jié)性流行中占有很高比重，給人類的公共衛(wèi)生健康造成了嚴(yán)重威脅。

2、預(yù)防和控制乙型流感最有效的方法是接種疫苗，目前的商品化流感滅活疫苗，大部分是基于世界衛(wèi)生組織(who)預(yù)測的候選毒株制備的三價或四價疫苗，能否預(yù)測成功會直接影響當(dāng)季疫苗的保護(hù)率。從確定候選毒株到商品化疫苗上市需要時間較長，預(yù)測失敗且無法快速制備出有效的流感疫苗將會導(dǎo)致當(dāng)季的流感大流行。

3、因此，研制出一種高效的具有廣譜活性的通用型流感疫苗對于預(yù)防流感流行具有重要意義。其中dna疫苗具有一定優(yōu)勢，dna疫苗是在真核表達(dá)載體上克隆一種或多種抗原編碼基因，再將構(gòu)建的重組質(zhì)粒直接免疫到體內(nèi)，從而激活機(jī)體免疫系統(tǒng)。與傳統(tǒng)疫苗相比，具有成本低、安全性高、方便存運等優(yōu)點，可長時間表達(dá)抗原，不受母源抗體干擾，具有與天然抗原相同的免疫原性，可同時激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，細(xì)胞免疫以及黏膜免疫。因此，基于現(xiàn)有技術(shù)中乙型流感疫苗存在的問題，設(shè)計一種新型的通用型乙型流感疫苗非常必要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案：

3、一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法，包括以下步驟：

4、步驟1：下載2022-2023年疫苗株推薦組分中的乙型流感推薦毒株b/austria/1359417/2021序列信息，對該毒株ha基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后進(jìn)行基因合成，基因命名為bha；

5、步驟2：選擇ha蛋白、m2e蛋白和na蛋白高度保守性序列進(jìn)行串聯(lián)組合，密碼子優(yōu)化后進(jìn)行基因合成，基因命名為g3；

6、步驟3：分別提取合成片段的質(zhì)粒dna備用；

7、步驟4：利用pcr技術(shù)進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，以便于連接載體；

8、步驟5：進(jìn)行目的基因與載體連接實驗。

9、優(yōu)選的，所述步驟4中，擴(kuò)增引物如表1所示：

10、表1引物序列

11、

12、優(yōu)選的，所述步驟4中，pcr體系如表2所示：

13、表2pcr體系

14、

15、優(yōu)選的，所述步驟4中，pcr反應(yīng)程序如表3所示：

16、表3pcr反應(yīng)程序

17、

18、優(yōu)選的，所述步驟4中，擴(kuò)增產(chǎn)物使用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳。

19、優(yōu)選的，所述步驟5中，進(jìn)行目的基因與載體連接實驗的具體方法步驟為：

20、步驟5.1：使用限制性內(nèi)切酶ndeⅰ對pvax1-ires載體進(jìn)行單酶切后，使用無縫克隆試劑盒將ha與線性pvax1-ires載體進(jìn)行連接；

21、步驟5.2：使用限制性內(nèi)切酶xhoⅰ對pvax1—bha-ires載體進(jìn)行單酶切后，使用無縫克隆試劑盒將g3與線性pvax1-bha-ires進(jìn)行連接；

22、步驟5.3：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞trans-t1后擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒dna，選擇限制性內(nèi)切酶ndeⅰ和xhoⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定，使用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳；

23、步驟5.4：質(zhì)粒dna序列經(jīng)測序鑒定正確，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pvax-bhag3。

24、優(yōu)選的，所述步驟5.1中，連接體系如表4所示：

25、表4連接體系

26、

27、優(yōu)選的，所述步驟5.2中，連接體系如表5所示：

28、表5連接體系

29、

30、????????????????????????????????????????????????????????????????????

31、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)取得了以下技術(shù)效果：

32、本發(fā)明dna疫苗的ha蛋白序列可利用酶切位點進(jìn)行快速替換，且制備方法簡單，免疫原性良好，交叉保護(hù)性良好，制備成本低，能滿足大批量流感疫苗的制備需求，具有重要的科學(xué)意義和社會價值。

技術(shù)特征：

1.一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法，其特征在于，所述步驟4中，擴(kuò)增引物如表1所示：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法，其特征在于，所述步驟4中，pcr體系如表2所示：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法，其特征在于，所述步驟4中，pcr反應(yīng)程序如表3所示：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法，其特征在于，所述步驟4中，擴(kuò)增產(chǎn)物使用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法，其特征在于，所述步驟5中，進(jìn)行目的基因與載體連接實驗的具體方法步驟為：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法，其特征在于，所述步驟5.1中，連接體系如表4所示：

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種乙型流感dna疫苗的構(gòu)建及鑒定方法，其特征在于，所述步驟5.2中，連接體系如表5所示：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種乙型流感DNA疫苗的構(gòu)建及鑒定方法，包括以下步驟：步驟1：下載2022?2023年疫苗株推薦組分中的乙型流感推薦毒株B/Austria/1359417/2021序列信息，對該毒株HA基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后進(jìn)行基因合成，基因命名為BHA；步驟2：選擇HA蛋白、M2e蛋白和NA蛋白高度保守性序列進(jìn)行串聯(lián)組合，密碼子優(yōu)化后進(jìn)行基因合成，基因命名為G3；步驟3：分別提取合成片段的質(zhì)粒DNA備用；步驟4：利用PCR技術(shù)進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，以便于連接載體；步驟5：進(jìn)行目的基因與載體連接實驗。本發(fā)明DNA疫苗的HA蛋白序列可利用酶切位點進(jìn)行快速替換，且制備方法簡單，免疫原性良好，交叉保護(hù)性良好，制備成本低，能滿足大批量流感疫苗的制備需求，具有重要的科學(xué)意義和社會價值。

技術(shù)研發(fā)人員：金寧一,魯會軍,朱翔宇,趙文欣,哈卓,張赫,謝宇飚
受保護(hù)的技術(shù)使用者：軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6