本發(fā)明涉及類器官構(gòu)建，尤其涉及一種肝母細(xì)胞瘤類器官的體外培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、肝母細(xì)胞瘤是一種主要發(fā)生于兒童的惡性腫瘤，其病理特征和治療難度使得研究肝母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)有效的治療方法變得非常重要。目前對(duì)肝母細(xì)胞瘤的研究方式是二維細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型，難以完全模擬肝母細(xì)胞瘤的復(fù)雜病理特征。

2、類器官技術(shù)作為一種新興的三維細(xì)胞培養(yǎng)方法，通過(guò)在體外培養(yǎng)出與真實(shí)器官相似的三維結(jié)構(gòu)和功能，能夠模擬真實(shí)器官的組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和生理功能，如呼吸、排泄、分泌和感知等，因而有助于更好地了解器官的特性和功能，探索其在健康和疾病狀態(tài)下的變化。并且，類器官可以使用人類來(lái)源的細(xì)胞培養(yǎng)而成，因此更能準(zhǔn)確地反映人體器官對(duì)藥物的反應(yīng)和疾病的影響，這不僅使得研究結(jié)果更可靠，還減少了對(duì)動(dòng)物的使用，避免了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的倫理和道德問(wèn)題。因此，建立肝母細(xì)胞瘤類器官模型，將為肝母細(xì)胞瘤的研究提供新的途徑，有助于對(duì)肝母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)制以及診斷和治療手段的研究。

3、現(xiàn)有的構(gòu)建肝母細(xì)胞瘤的方法是從胚肝細(xì)胞出發(fā)，構(gòu)建胚肝類器官后，再采用表達(dá)特定基因的慢病毒感染，使胚肝類器官轉(zhuǎn)變成肝母細(xì)胞瘤(如專利cn116004722a)，存在操作復(fù)雜、構(gòu)建周期長(zhǎng)、成本較高、對(duì)實(shí)驗(yàn)室安全等級(jí)要求較高的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有的肝母細(xì)胞瘤類器官構(gòu)建方法操作復(fù)雜、構(gòu)建周期長(zhǎng)、成本較高、對(duì)實(shí)驗(yàn)室安全等級(jí)要求較高的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種肝母細(xì)胞瘤類器官的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)肝母細(xì)胞瘤類器官的成功構(gòu)建，且操作較為簡(jiǎn)單安全，獲得類器官所需時(shí)間較短，成本較低。

2、本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：

3、一種肝母細(xì)胞瘤類器官的體外培養(yǎng)方法，步驟包括：

4、i：制備分散有肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凝固膠滴；

5、ii：將包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、毛喉素和n-乙酰-l-半胱氨酸在內(nèi)的生長(zhǎng)因子加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，制成構(gòu)建培養(yǎng)液；

6、iii：采用構(gòu)建培養(yǎng)液浸沒(méi)凝固膠滴，培養(yǎng)得到肝母細(xì)胞瘤類器官。

7、本發(fā)明中，通過(guò)先將肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞制備成凝固膠滴，再采用含有特定組分的構(gòu)建培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)，成功實(shí)現(xiàn)了肝母細(xì)胞瘤類器官的構(gòu)建，并且，由此獲得的肝母細(xì)胞瘤類器官具有清晰完整的結(jié)構(gòu)形態(tài)，在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠維持穩(wěn)定，且能夠在該構(gòu)建培養(yǎng)液中穩(wěn)定傳代。采用本發(fā)明的方法構(gòu)建肝母細(xì)胞瘤類器官，操作較為簡(jiǎn)單，獲得類器官所需時(shí)間較短。

8、在本發(fā)明所使用的構(gòu)建培養(yǎng)液中，經(jīng)試驗(yàn)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、毛喉素和n-乙酰-l-半胱氨酸對(duì)肝母細(xì)胞瘤類器官的構(gòu)建具有重要影響，當(dāng)缺少其中任何一者時(shí)，均會(huì)造成該類器官生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，活性差，甚至無(wú)法構(gòu)建得到該類器官。

9、作為優(yōu)選，步驟ii中，所述構(gòu)建培養(yǎng)液中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的含量為105～320ng/ml，毛喉素的含量為45～55ng/ml，n-乙酰-l-半胱氨酸的含量為1～2mmol/l。

10、作為優(yōu)選，步驟ii中，所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-10(fgf-10)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)，在構(gòu)建培養(yǎng)液中的含量分別為100～300ng/ml和5～20ng/ml。

11、作為優(yōu)選，步驟ii中，所述生長(zhǎng)因子還包括：

12、 生長(zhǎng)因子名稱 在構(gòu)建培養(yǎng)液中的含量 4-羥乙基哌嗪乙磺酸 5～10mmol/l l-谷氨酰胺 5～15mmol/l 無(wú)血清添加劑 1.5～4.5％vol 表皮生長(zhǎng)因子 50～100ng/ml tgf-βi型受體抑制劑 0.3～1.0μmol/l 骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑 250～500ng/ml wnt信號(hào)通路增強(qiáng)劑 100～250ng/ml 胃泌素 10～30ng/ml rho相關(guān)蛋白激酶抑制劑 5～15μm

13、進(jìn)一步地，所述無(wú)血清添加劑包括無(wú)血清nsc-27添加劑和無(wú)血清n-2添加劑，在構(gòu)建培養(yǎng)液中的含量分別為1～3％vol和0.5～1.5％vol。

14、在構(gòu)建培養(yǎng)液中，各生長(zhǎng)因子對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有不同的影響，本發(fā)明中采用由上述各生長(zhǎng)因子構(gòu)成的整體體系，各生長(zhǎng)因子之間相互配合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了肝母細(xì)胞瘤類器官的成功構(gòu)建和穩(wěn)定傳代。

15、雖然現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道過(guò)一些構(gòu)建其他腫瘤類器官的培養(yǎng)液，但培養(yǎng)液配方在不同腫瘤類器官之間并不能通用，并且，細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)極為復(fù)雜，構(gòu)建培養(yǎng)液中的成分通過(guò)影響細(xì)胞代謝活動(dòng)，進(jìn)而影響類器官的形成，其中所涉及的因素是多方面、相互交叉且錯(cuò)綜復(fù)雜的，這為研究帶來(lái)了很大的難度。

16、作為優(yōu)選，步驟ii中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。

17、作為優(yōu)選，步驟i中，所述凝固膠滴的體積為50～100μl，每個(gè)凝固膠滴中含有肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞1.5×105～2.5×105個(gè)。

18、作為優(yōu)選，步驟i中，所述肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞的制備步驟包括：將人肝母細(xì)胞腫瘤組織清洗和剪碎后，依次采用膠原酶i和分散酶ii進(jìn)行消化，從產(chǎn)物中收集得到肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞。

19、進(jìn)一步地，在依次采用膠原酶i和分散酶ii進(jìn)行消化后，收集消化產(chǎn)物，裂解其中的紅細(xì)胞后，濾除成團(tuán)組織，從濾液中收集得到肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞。

20、作為優(yōu)選，步驟i包括：將肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞分散到基質(zhì)膠中，滴加到培養(yǎng)容器內(nèi)，凝固后，形成分散有肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凝固膠滴。

21、作為優(yōu)選，步驟iii中，每個(gè)凝固膠滴使用構(gòu)建培養(yǎng)液800～1000μl，所述培養(yǎng)的條件如下：環(huán)境溫度為35～37℃，環(huán)境co2濃度為4～6％，每2～3天更換一次構(gòu)建培養(yǎng)液。

22、作為優(yōu)選，步驟iii中，在構(gòu)建得到肝母細(xì)胞瘤類器官，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，步驟包括：i：將肝母細(xì)胞瘤類器官解離成細(xì)胞；

23、ii：制備分散有步驟i中所得細(xì)胞的凝固膠滴；

24、iii：采用所述構(gòu)建培養(yǎng)液，浸沒(méi)步驟ii所得凝固膠滴，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

25、本發(fā)明在構(gòu)建得到肝母細(xì)胞瘤類器官后，所使用的構(gòu)建培養(yǎng)液配方還能夠用于后續(xù)肝母細(xì)胞瘤類器官的穩(wěn)定傳代。

26、作為優(yōu)選，步驟i中，采用tryple消化液將肝母細(xì)胞瘤類器官解離成細(xì)胞。

27、作為優(yōu)選，步驟ii中，所述凝固膠滴內(nèi)的細(xì)胞含量按照1:2～3的傳代比例設(shè)置。

28、作為優(yōu)選，步驟iii中，每個(gè)凝固膠滴使用構(gòu)建培養(yǎng)液800～1000μl，所述傳代培養(yǎng)的條件如下：環(huán)境溫度為35～37℃，環(huán)境co2濃度為4～6％。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

30、本發(fā)明中，通過(guò)先將肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞制備成凝固膠滴，再采用特定的構(gòu)建培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了肝母細(xì)胞瘤類器官的成功構(gòu)建以及后續(xù)的穩(wěn)定傳代，且操作簡(jiǎn)單安全，耗時(shí)較短，成本較低，為肝母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)制以及診斷和治療手段的研究提供了能夠更好地模擬人體真實(shí)器官的模型。