本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，特別涉及一種庫蚊新沃爾巴克氏體亞型及其檢測引物、檢測方法、檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、沃爾巴克氏菌(wolbachia)又稱為沃爾巴克氏體，是一種經(jīng)由母系傳播的專性細(xì)胞內(nèi)共生菌，最早發(fā)現(xiàn)于尖音庫蚊的生殖組織中。沃爾巴克氏菌在自然界中廣泛分布，超過65％的昆蟲天然感染沃爾巴克氏菌。沃爾巴克氏體感染蚊蟲后，能夠?qū)е滤拗鳟a(chǎn)生胞質(zhì)不相容性現(xiàn)象，進(jìn)而影響蚊蟲的繁殖；另一方面能夠阻斷蚊蟲體內(nèi)病原體(如登革病毒、寨卡病毒)的復(fù)制與增殖，從而阻隔相關(guān)病原體的傳播，可應(yīng)用于蚊媒傳染病的現(xiàn)場防控。

2、不同昆蟲所攜帶的沃爾巴克氏菌亞型不同，發(fā)現(xiàn)新的亞型有利于更精準(zhǔn)地控制蚊媒傳染病的傳播，還可以幫助研究人員深入了解沃爾巴克氏菌與昆蟲的相互作用機(jī)制。

3、要充分利用沃爾巴克氏菌的潛力，準(zhǔn)確識別和區(qū)分不同亞型至關(guān)重要。因此，開發(fā)針對不同沃爾巴克氏菌亞型的特異性檢測方法就顯得尤為重要。沃爾巴克氏菌常用的檢測方法有聚合酶鏈反應(yīng)法(pcr法)、免疫染色和電鏡法，不同方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。pcr法靈敏簡單，但容易產(chǎn)生假陽性，也不能說明沃爾巴克氏菌在蚊體內(nèi)分布的情況。免疫染色法所使用的幾種抗體都存在不同程度的非特異染色，不易解讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。電鏡法能夠提供沃爾巴克氏菌在蚊體內(nèi)分布的直接證據(jù)，但其需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的技術(shù)，日常研究工作中使用不方便。因此，發(fā)明新的檢測方法有利于快速精準(zhǔn)地檢測沃爾巴克氏菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種庫蚊新沃爾巴克氏體亞型及其檢測引物、檢測方法、檢測試劑盒。

2、為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明方案如下：

3、一方面，本發(fā)明提供一種庫蚊新沃爾巴克氏體亞型基因，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、為了實(shí)現(xiàn)庫蚊新沃爾巴克氏體亞型基因的檢測，本發(fā)明還提供一種庫蚊新沃爾巴克氏體亞型的檢測引物、探針以及含有該引物、探針的試劑盒。所述檢測引物的序列如seqid?no.3和seq?id?no.4所示。所述熒光探針的序列如seq?id?no.2所示，探針的兩端分別結(jié)合熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。

5、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供一種非疾病診斷和治療目的的庫蚊新沃爾巴克氏體亞型的檢測方法，包括以下步驟：

6、提取樣品基因組dna，以該樣品dna為模板，使用如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的檢測引物，以及如seq?id?no.2所示的熒光探針，進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)完成后，讀取并記錄樣品的pcr循環(huán)次數(shù)ct，根據(jù)樣品的ct值，判斷樣品是否含有庫蚊新沃爾巴克氏菌亞型。

7、進(jìn)一步的，pcr擴(kuò)增體系：

8、模板dna?1μl、2x?taqman?fast?qpcr?master?mix緩沖液10μl、10μmol/l探針0.2μl、10μmol/l檢測引物各0.3μl、去離子水8.7μl。

9、進(jìn)一步的，pcr反應(yīng)條件：

10、94℃3min；94℃5s；60℃30s，40個循環(huán)；60℃時收集熒光。

11、進(jìn)一步的，根據(jù)樣品的ct值判斷樣品是否含有庫蚊新沃爾巴克氏菌亞型的方法為：

12、如果出現(xiàn)待測基因的擴(kuò)增反應(yīng)曲線，且ct值小于38，則判斷為陽性；如果38<ct<40，判斷為可疑，加大模板量，重復(fù)擴(kuò)增，如果得到相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，則判斷為陽性，否則為陰性；如果ct值為0或40，則判斷為陰性。

13、進(jìn)一步的，所述樣品包括庫蚊、伊蚊。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

15、本發(fā)明公開一種庫蚊新沃爾巴克氏體亞型，針對該亞型的基因序列，設(shè)計(jì)了特異性的檢測引物和探針。利用本發(fā)明的熒光檢測引物和探針，按照本發(fā)明的檢測方法能夠快速高效專一的檢測出庫蚊新沃爾巴克氏菌亞型。本發(fā)明具有特異性高(只檢測出庫蚊新沃爾巴克氏菌亞型，而伊蚊沃爾巴克氏菌a型和b型不發(fā)生擴(kuò)增)，靈敏度高(最低檢測限為100copies/ml)等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)特征：

1.一種庫蚊新沃爾巴克氏體亞型基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq?idno.1所示。

2.一種庫蚊新沃爾巴克氏體亞型的檢測引物，其特征在于，所述庫蚊新沃爾巴克氏體亞型的基因序列如seq?id?no.1所示，所述檢測引物的序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。

3.一種庫蚊新沃爾巴克氏體亞型的檢測試劑盒，其特征在于，其包含權(quán)利要求1所述的檢測引物。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，還包含熒光探針，所述熒光探針的序列如seq?id?no.2所示，探針的兩端分別結(jié)合熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。

5.一種非疾病診斷和治療目的的庫蚊新沃爾巴克氏體亞型的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，pcr擴(kuò)增體系：

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，pcr反應(yīng)條件：

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，根據(jù)樣品的ct值判斷樣品是否含有庫蚊新沃爾巴克氏菌亞型的方法為：

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述樣品包括庫蚊、伊蚊。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種庫蚊新沃爾巴克氏體亞型及其檢測引物、檢測方法、檢測試劑盒。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種新型沃爾巴克氏體亞型，針對該新型沃爾巴克氏體的基因片段設(shè)計(jì)了特異性檢測引物和探針、檢測方法。利用本發(fā)明的檢測引物和探針，按照本發(fā)明的檢測方法能夠快速高效專一的檢測出庫蚊新沃爾巴克氏菌亞型。本發(fā)明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：李婷婷,李奕基
受保護(hù)的技術(shù)使用者：海南醫(yī)科大學(xué)（海南省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30