本發(fā)明屬于生物，具體涉及dspcka基因在調控d.segeticola致病力和作為殺菌劑靶標中的應用。

背景技術：

1、亞隔孢殼屬(didymella)屬子囊菌門(ascomycota)座囊菌綱(dothideomycetes)格孢腔菌目(pleosporales)亞隔孢殼科(didymellaceae)，該屬的真菌對部分植物具有一定的致病性。didymella?segeticola是該屬中一種植物病原菌，能夠引起多種植物疾病，尤其會對多種經濟作物和其它重要的植物種類造成危害，造成巨大經濟損失，比如，可引起花椒葉斑病(yang,j.z.,chen,c.x.,et?al.didymella?segeticola?is?a?new?pathogencausing?leaf?spot?disease?on?zanthoxylum?bungeanum.new?zealand?journal?ofcrop?and?horticultural?science,2022,51:694-703)、煙草葉斑病(guo,z.n.,xie,h.l.,et?al.leaf?spot?caused?by?didymella?segeticola?on?tobacco?in?china.plantdisease,2019,104:1559-1560)、茶葉斑病(deng,x.y.,yang,j.,et?al.characteristicsof?leaf?spot?disease?caused?by?didymella?species?and?the?influence?ofinfection?on?tea?quality.phytopathology,2023,113:516-527)。d.segeticola菌株gzsq-4(中國普通微生物菌種保藏中心，菌種保藏號cgmcc3.20152)是由本發(fā)明人所在課題組從貴州省石阡縣茶區(qū)茶葉斑病上分離鑒定，該病菌可侵染茶樹新梢、嫩葉和成葉，對茶葉的品質和產量造成嚴重影響。

2、但是至目前國內外對d.segeticola的病原生物學的研究仍然較為薄弱，尤其缺乏病原菌致病機制和寄主防御響應機制的報道。盡管當前對病原菌d.segeticola有一定的研究，并在生產上篩選出能防控d.segeticola的殺菌劑，如中生菌素、申嗪霉素、灰黃霉素、香芹酚等生物農藥(ren,y.f.,li,d.x.,et?al.integration?of?transcriptomic?andproteomic?data?reveals?the?possible?action?mechanism?of?the?antimicrobialzhongshengmycin?against?didymella?segeticola,the?causal?agent?of?tea?leafspot.phytopathology,2021,111:2238-2249；zhao,x.z.,chen,z.,et?al.investigatingthe?antifungal?activity?and?mechanism?of?a?microbial?pesticide?shenqinmycinagainst?phoma?sp.pesticide?biochemistry?and?physiology,2018,147:46-50；huang,h.k.,li,d.x.,et?al.integrated?transcriptome?and?proteome?analysis?revealsthat?the?antimicrobial?griseofulvin?targets?didymella?segeticola?beta-tubulinto?control?tea?leaf?spot.phytopathology,2023,113:194-205；yin,j.y.,wu,s.,etal.in?addition?to?damaging?the?plasma?membrane,phenolic?monoterpenoidcarvacrol?can?bind?to?minor?groove?of?dna?of?phytopathogenic?fungi?topotentially?control?tea?leaf?spot?caused?by?lasiodiplodiatheobromae.phytopathology,2023,114:700-716)。但由于d.segeticola的致病機制和侵染機制不清，限制了殺菌劑的開發(fā)和應用，因此構建d.segeticola殺蟲劑靶標篩選模型、研究殺菌劑的作用機制顯得非常重要。

3、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate?carboxykinase)基因家族廣泛存在于多種生物體中，包括細菌、原生動物和酵母。有的在糖異生過程中發(fā)揮著作用，特別是在脂肪酸作為主要碳源的生物體中(liu,k.,yu,j.,russell,d.g.pcka-deficientmycobacterium?bovis?bcg?shows?attenuated?virulence?in?mice?and?inmacrophages.microbiology,2003,149,1829-1835)。有的催化草酰乙酸轉化為磷烯醇丙酮酸，這一反應是糖異生途徑中的第一步，也是連接三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑的關鍵環(huán)節(jié)。本發(fā)明從d.segeticola中獲得的一個磷酸烯醇丙酮酸羧激酶家族基因(命名為dspcka)，與d.segeticola致病力相關，對全面了解d.segeticola的致病機理，為d.segeticola所致病害的防控和植物抗病品種的選育提供了重要數據。

技術實現思路

1、鑒于此，本發(fā)明提供一磷酸烯醇丙酮酸羧激酶家族基因，該基因來源于didymellasegeticola，在本發(fā)明中被命名為dspcka，該基因核苷酸序列為如seq?id?no.1或seq?idno.2所示，所編碼的氨基酸序列為如seq?id?no.3所示。該基因可以解決防控病原菌d.segeticola的問題。由此本發(fā)明的目的具體為：

2、第1方面，提供dspcka基因在調控d.segeticola的致病力，或對寧南霉素的敏感性，或設計和篩選抗真菌藥物中的應用。

3、進一步地，調控d.segeticola的致病力和對寧南霉素的敏感性中的調控均為降低。比如敲除d.segeticola中的dspcka基因后，d.segeticola的致病力降低，對寧南霉素的敏感性也降低。

4、第2方面，提供dspcka基因在培育致病力降低和/或對寧南霉素的敏感性降低的轉基因d.segeticola中的應用。比如可以通過構建dspcka基因的敲除突變體，獲得致病力和對寧南霉素的敏感性均降低的轉基因d.segeticola。

5、第3方面，提供一種培育致病力降低和/或對寧南霉素的敏感性降低的轉基因d.segeticola的方法，該方法包括降低受體d.segeticola中的dspcka基因的mrna或蛋白的表達量或/和活性，得到轉基因d.segeticola的步驟。

6、進一步地，降低dspcka基因的mrna或蛋白的表達量或/和活性是通過對受體d.segeticola中的dspcka基因進行敲除或抑制或沉默表達而實現的。比如通過同源重組的方法，將用于進行同源重組的同源重組片段導入受體的原生質體中對受體d.segeticola中的dspcka基因進行敲除。

7、第4方面，提供上述方法在防治由d.segeticola引起的病害中的應用。降低受體d.segeticola中的dspcka基因的mrna或蛋白的表達量或/和活性后，d.segeticola的致病力降低，從而防治其引起的病害。

8、第5方面，提供dspcka蛋白作為藥物靶標在篩選殺菌劑中的應用。dspcka蛋白即為dspcka基因所編碼。

9、進一步地，dspcka蛋白中的t264、t265和e306位氨基酸作為藥物靶標篩選殺菌劑。

10、第6方面，提供寧南霉素作為殺菌劑成分在防治d.segeticola引起的病害中的應用。寧南霉素與dspcka蛋白具有相互作用，二者結合親和力強，寧南霉素與dspcka蛋白的結合使dspcka蛋白的結構變化、活性降低或受抑制，從而達到抑制病原菌對植物的危害。

11、第7方面，提供寧南霉素在調控dspcka蛋白結構或活性中的應用。

12、本發(fā)明提供了來源于d.segeticola的一磷酸烯醇丙酮酸羧激酶家族基因dspcka在調控d.segeticola的致病力和對寧南霉素的敏感性中的應用。通過對野生型d.segeticola中dspcka基因進行敲除后發(fā)現，敲除后的d.segeticola的致病力和對寧南霉素的敏感性均顯著降低。本發(fā)明dspcka蛋白由dspcka基因編碼，可以作為藥物靶標篩選殺菌劑，其與殺菌劑成分寧南霉素具有相互作用，二者結合親和力強，可通過寧南霉素與dspcka蛋白的結合使dspcka蛋白的結構變化、活性降低或受抑制，從而抑制病原菌對植物的危害。由此，dspcka可作為殺菌劑靶標和病害致病機制的關鍵蛋白，且t264、t265和e306位氨基酸為關鍵結合位點，在植物病原真菌病害的防治中具有廣闊的應用前景。