本發(fā)明涉及一種生物工程，具體涉及一種增大細(xì)胞尺寸的方法、重組大腸桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、微生物作為細(xì)胞工廠越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)大分子、小分子化學(xué)品等高附加值產(chǎn)品。傳統(tǒng)的提高細(xì)胞生產(chǎn)效率的方法包括細(xì)胞代謝途徑優(yōu)化，如強(qiáng)化途徑基因表達(dá)、失活競(jìng)爭(zhēng)抑制途徑，或是通過(guò)細(xì)胞耐受性馴化，很少有通過(guò)調(diào)控細(xì)胞體積來(lái)強(qiáng)化生產(chǎn)的研究。另一方面，已有研究表明通過(guò)紫外照射等方式能使得細(xì)胞體積和表面積增大(allison?dp.giant?cells?of?escherichia?coli:a?morphological?study.jbacteriol.1971dec；108(3):1390-401.)，但這種現(xiàn)象可能是一種細(xì)胞衰亡的前兆，無(wú)法分裂和穩(wěn)定遺傳。通過(guò)操縱與細(xì)胞形態(tài)相關(guān)的基因從而控制細(xì)胞的形狀和分裂模式作為一種新策略為構(gòu)建高效微生物細(xì)胞工廠提供了更多的可能性，這種改變是可分裂、可培養(yǎng)、可遺傳的。經(jīng)形態(tài)改造細(xì)胞生長(zhǎng)速率提高、體積擴(kuò)大，表面積增大，由于易于沉降還可簡(jiǎn)化下游分離過(guò)程，能夠提高生產(chǎn)效率并降低生產(chǎn)成本。

2、目前，僅有少數(shù)基因如mreb和ftsz被報(bào)道通過(guò)改造細(xì)胞形狀和分裂模式提高了細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)，需要進(jìn)一步探索更多細(xì)胞形態(tài)學(xué)相關(guān)基因的合理應(yīng)用。diviva是一種膜結(jié)合蛋白，是細(xì)胞分裂相關(guān)系統(tǒng)min系統(tǒng)的成員。它能夠感知膜曲率，將其他蛋白募集到兩極和分裂隔膜，參與細(xì)菌隔膜形成的空間調(diào)節(jié)。diviva在革蘭氏陽(yáng)性菌中高度保守，參與許多不同的過(guò)程，并作為需要定位于細(xì)胞分裂位點(diǎn)或細(xì)胞極的蛋白質(zhì)的支架發(fā)揮作用。在大腸桿菌中異源表達(dá)diviva可以調(diào)控大腸桿菌細(xì)胞分裂、染色體分離以及細(xì)胞壁合成等細(xì)胞生長(zhǎng)生理活動(dòng)。目前對(duì)于diviva的研究大多集中在分裂機(jī)制，而非調(diào)控細(xì)胞尺寸，進(jìn)一步應(yīng)用于生物分子的生產(chǎn)，將其它細(xì)胞分裂相關(guān)基因組合對(duì)菌株進(jìn)行改造也未見(jiàn)報(bào)道，如mreb、minc、mind、mine、ftsz、daca等。

3、其中，類肌動(dòng)蛋白基因mreb與細(xì)胞合成肽聚糖層的酶密切相關(guān)，它通過(guò)調(diào)控細(xì)菌細(xì)胞壁合成途徑參與細(xì)胞形態(tài)的維持。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)大腸桿菌及沙門(mén)氏菌等桿狀細(xì)菌的mreb突變時(shí)，細(xì)胞會(huì)變?yōu)榍驙睢Ｔ诖竽c桿菌中，min系統(tǒng)的蛋白質(zhì)包括minc、mind和mine，其中minc和mind通過(guò)阻止ftsz復(fù)合物在細(xì)胞中間以外的位置組裝，控制z環(huán)處于細(xì)胞中間位置。mine是mincd的負(fù)調(diào)節(jié)劑，有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，n端結(jié)構(gòu)與能夠特異性解除mincd在細(xì)胞膜上的聚合，從而抑制mincd功能；c端結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別細(xì)胞潛在的三個(gè)分裂位點(diǎn)，控制mine在細(xì)胞中部，將mincd復(fù)合物限制在細(xì)胞兩極。在失活mincd的情況下，細(xì)胞在兩極以及細(xì)胞中間分裂，形成無(wú)dna的小細(xì)胞；過(guò)表達(dá)mine的n端結(jié)構(gòu)域也能促進(jìn)小細(xì)胞的形成。大腸桿菌青霉素結(jié)合蛋白5(pbp5)是一種由daca基因編碼的dd-羧肽酶，在維持細(xì)胞形狀中起關(guān)鍵作用。它的功能缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常分裂，使得細(xì)胞由初始桿狀形態(tài)分別形成小球狀細(xì)胞和伴隨有小細(xì)胞的纖維狀細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種增大細(xì)胞尺寸的方法。

2、本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種增大細(xì)胞尺寸的重組大腸桿菌。

3、本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述重組大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)生物大分子中的應(yīng)用。

4、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

5、一種增大細(xì)胞尺寸的方法，將底盤(pán)菌株通過(guò)異源表達(dá)細(xì)胞分裂蛋白diviva，增大大腸桿菌中細(xì)胞尺寸。

6、一種增大細(xì)胞尺寸的重組大腸桿菌，其特征在于，將底盤(pán)菌株通過(guò)異源表達(dá)細(xì)胞分裂蛋白diviva構(gòu)建得到的。

7、其中，所述底盤(pán)菌株為原始大腸桿菌，或原始大腸桿菌強(qiáng)化了拓?fù)涮禺愋砸蜃觤ine基因表達(dá)的菌株，或原始大腸桿菌弱化了肌動(dòng)蛋白樣蛋白mreb、z環(huán)蛋白基因ftsz、分裂因子minc、mind或青霉素結(jié)合蛋白daca中的任意一個(gè)或幾個(gè)蛋白基因表達(dá)。

8、優(yōu)選的，所述底盤(pán)菌株為弱化了肌動(dòng)蛋白樣蛋白編碼基因mreb、分裂因子minc和青霉素結(jié)合蛋白基因daca中的任意一個(gè)蛋白基因表達(dá)的大腸桿菌。

9、其中，所述原始大腸桿菌為bl21(de3)野生菌或mg1655(de3)野生菌中的任意一種。

10、優(yōu)選的，所述底盤(pán)菌株為bl21(de3)野生菌、mg1655(de3)野生菌、bl21(de3)△minc、mg1655(de3)△minc、bl21(de3)△mreb、mg1655(de3)△mreb、bl21(de3)△daca和mg1655(de3)△daca中的任意一種或幾種的組合。

11、其中，所述bl21(de3)△minc、mg1655(de3)△minc菌株是分別以bl21(de3)野生菌和mg1655(de3)野生菌出發(fā)失活minc得到的；所述bl21(de3)△mreb、mg1655(de3)△mreb菌株是分別以bl21(de3)野生菌和mg1655(de3)野生菌出發(fā)失活mreb得到的；bl21(de3)△daca、mg1655(de3)△daca菌株是分別以bl21(de3)野生菌和mg1655(de3)野生菌出發(fā)失活daca得到的。

12、所述基因失活方式為crispr/cas9編輯技術(shù)([1]jiang,y,et?al.,multigeneediting?in?the?escherichia?coli?genome?via?the?crispr-cas9?system[j].或mucicat技術(shù)或λ-red同源重組技術(shù)([2]madyagol,m.et?al.,2011.gene?replacementtechniques?for?escherichia?coli?genome?modification[j].)。

13、其中，所述細(xì)胞分裂蛋白diviva，其氨基酸序列長(zhǎng)度如seq?id?no.1所示，或與seqid?no.1序列相似性大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的序列。

14、其中，所述如seq?id?no.1所示的氨基酸序列，其來(lái)源于枯草芽胞桿菌bacillussubtilis?168。

15、優(yōu)選的，所述細(xì)胞分裂蛋白diviva可以來(lái)源于表1所列的任意一種。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞分裂蛋白diviva為seq?id?no.1所示的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

16、其中，所述肌動(dòng)蛋白樣蛋白mreb，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述分裂因子minc，其氨基酸序列如seq?id?no.5所示，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；所述青霉素結(jié)合蛋白daca，其氨基酸序列如seq?id?no.7所示，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；所述分裂因子mind如seq?id?no.9所示，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如seq?id?no.10所示；所述拓?fù)涮禺愋砸蜃觤ine如seq?id?no.11所示，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如seq?id?no.12所示；所述z環(huán)蛋白基因ftsz如seq?id?no.13所示，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如seq?id?no.14所示。

17、表1細(xì)胞分裂蛋白diviva來(lái)源情況

18、

19、其中，所述異源表達(dá)細(xì)胞分裂蛋白diviva為以下兩種表達(dá)方式中的任意一種：表達(dá)方式一：將細(xì)胞分裂蛋白基因diviva以質(zhì)粒過(guò)表達(dá)的方式轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)；表達(dá)方式二：將細(xì)胞分裂蛋白基因diviva在大腸桿菌基因組上進(jìn)行多拷貝基因組整合表達(dá)。

20、具體的，所述表達(dá)方式一具體是將細(xì)胞分裂蛋白基因diviva通過(guò)linker融合egfp后構(gòu)建到過(guò)表達(dá)質(zhì)粒上，再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中表達(dá)；所述表達(dá)方式二具體是將整合有細(xì)胞分裂蛋白基因diviva和laci基因片段的整合片段構(gòu)建到第一整合表達(dá)質(zhì)粒上得到重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒與第二整合表達(dá)質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。

21、其中，表達(dá)方式一中，所述過(guò)表達(dá)質(zhì)粒包括但不限于petduet、pet28a、pacycduet、pcoladuet等質(zhì)粒，現(xiàn)有技術(shù)中只要能夠滿足diviva基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)的質(zhì)粒均適用于本發(fā)明。

22、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒為petduet或pet28a。

23、其中，表達(dá)方式二中，所述的用于基因組整合的質(zhì)粒包括但不限于pqcastns4array、pqcastns?8array、pqcastns?dif8array、pdonor、peccas、ptarget等質(zhì)粒，現(xiàn)有技術(shù)中只要能夠滿足將diviva基因整合至大腸桿菌基因組上進(jìn)行表達(dá)的質(zhì)粒均適用于本發(fā)明。

24、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述整合表達(dá)質(zhì)粒為pdonor和pqcastns?8array，具體的，pdonor為第一整合表達(dá)質(zhì)粒，pqcastns?8array為第二整合表達(dá)質(zhì)粒。

25、其中，所述多拷貝基因組整合表達(dá)，其拷貝數(shù)為1～20拷貝。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述拷貝數(shù)為1～8拷貝。

26、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，通過(guò)利用顯微鏡觀察對(duì)過(guò)表達(dá)diviva基因的菌株形態(tài)進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)不同菌株展現(xiàn)出了不同的細(xì)胞增大效果。bl21(de3)野生菌和mg1655(de3)野生菌形態(tài)多為長(zhǎng)度2μm的短桿狀，經(jīng)過(guò)基因工程改造后細(xì)胞被撐大，細(xì)胞直徑大于3μm、大于4μm、大于5μm，大于6μm、大于7μm、大于8μm、大于9μm、大于10μm、大于11μm、大于12μm、大于13μm、大于14μm、大于15μm、大于16μm、大于17μm、大于18μm、大于19μm或大于20μm。撐大的細(xì)胞形態(tài)包括變長(zhǎng)、變寬、變圓、出現(xiàn)分枝，呈現(xiàn)絲狀、蛇狀、啞鈴狀，橢圓形、球形、蝌蚪狀。

27、上述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法也在本發(fā)明所保護(hù)的范圍之內(nèi)。

28、在重組大腸桿菌構(gòu)建前，首先從ncbi上查到任意一個(gè)所需的細(xì)胞分裂蛋白diviva的蛋白質(zhì)序列，例如在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，diviva來(lái)源于枯草芽胞桿菌bacillussubtilis?168，序列如seq?id?no:1所示。然后根據(jù)大腸桿菌的密碼子使用偏好性，對(duì)細(xì)胞分裂蛋白基因diviva的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，人工合成diviva基因序列于pet28a質(zhì)粒，再將egfp融合至diviva的n末端，中間添加linker得到重組質(zhì)粒pet28a-diviva-egfp。

29、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法為如下兩種構(gòu)建方法中的任意一種：

30、(一)重組大腸桿菌的第一種構(gòu)建方法：

31、(1)以pet28a-diviva-egfp質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到diviva-egfp片段；

32、(2)將步驟(1)得到的diviva-egfp片段與線性化后的載體petduet連接，篩選得到正確的重組質(zhì)粒petduet-diviva-egfp；

33、(3)將步驟(2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主大腸桿菌中，得到表達(dá)diviva的重組大腸桿菌。

34、(二)重組大腸桿菌的第二種構(gòu)建方法：

35、本方法將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的diviva基因片段整合至已報(bào)道的基因組上的合適位點(diǎn)，通過(guò)mucicat基因編輯技術(shù)([3]yang?s,et?al.,orthogonal?crispr-associatedtransposases?for?parallel?and?multiplexed?chromosomal?integration[j].)整合到至大腸桿菌基因組一個(gè)或多個(gè)無(wú)意義位點(diǎn)。

36、(ⅰ)以petduet-diviva-egfp質(zhì)粒為模板，通過(guò)pcr擴(kuò)增得到diviva+laci基因片段；

37、(ⅱ)將步驟(ⅰ)所得diviva+laci基因片段構(gòu)建至pdonor質(zhì)粒的le和re之間得到pdonor-diviva-laci質(zhì)粒；

38、(ⅲ)將步驟(ⅱ)構(gòu)建完成的pdonor-diviva-laci質(zhì)粒和pqcastns-8array質(zhì)粒一同電轉(zhuǎn)至宿主大腸桿菌中，涂布至含有抗性的平板上培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落；

39、(ⅳ)將步驟(ⅲ)得到的菌落重懸后，用脫水四環(huán)素誘導(dǎo)質(zhì)粒表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)同時(shí)在基因組8個(gè)位點(diǎn)插入整合片段，最終通過(guò)菌落pcr驗(yàn)證篩選到分別整合1～8拷貝diviva的重組大腸桿菌。

40、其中，步驟(ⅲ)中，所述含有抗性為含有硫酸卡那霉素抗性和氯霉素抗性。

41、其中，步驟(ⅳ)中，所述脫水四環(huán)素其濃度為100～1000ng/ml。

42、上述重組大腸桿菌在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用也在本發(fā)明所保護(hù)的范圍之內(nèi)。該應(yīng)用的主要目的是利用所述重組大腸桿菌提高微生物發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)效率。

43、其中，所述發(fā)酵為搖瓶發(fā)酵，具體是將重組大腸桿菌在lb培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得到種子液，然后將菌株種子液以2％v/v接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)至菌體od600＝0.6～0.8之后加入iptg進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵。

44、通過(guò)操縱與微生物形態(tài)有關(guān)的各種基因改變其形狀，可以獲得尺寸增大的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞體積和表面積變大后，能容納胞內(nèi)生物分子的空間變大，單位生物量中有更多的空間可以用于生產(chǎn)和容納胞內(nèi)產(chǎn)物，從而能夠提高胞內(nèi)生物大分子的生產(chǎn)效率。被撐大的細(xì)胞更易沉降，有利于細(xì)胞截留、吸附、沉淀、產(chǎn)物分離等生產(chǎn)新工藝。

45、所述增大細(xì)胞尺寸，增大后的細(xì)胞會(huì)變長(zhǎng)、變寬、變圓、出現(xiàn)分支，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)絲狀、蛇狀、啞鈴狀，橢圓形、球形、蝌蚪狀。

46、其中，所述生物大分子包括核酸、蛋白質(zhì)、胞內(nèi)多糖中的任意一種。

47、具體的，所述核酸包括dna、rna或質(zhì)粒中的任意一種或幾種的組合；所述蛋白質(zhì)包括綠色熒光蛋白、葡萄糖脫氫酶、木糖還原酶、胞苷脫氨酶中的任意一種或幾種的組合；所述多糖包括透明質(zhì)酸、淀粉、葡聚糖、纖維素、寡聚糖、多聚糖中的任意一種或幾種的組合。

48、進(jìn)一步的，所述的dna包括雙鏈dna、單鏈dna或寡核酸(oligo?dna)中的任意一種或幾種的組合，所述的rna包括雙鏈rna(dsrna)或單鏈rna(ssrna)中的任意一種或幾種的組合，如信使rna(mrna)、核糖體rna(rrna)、轉(zhuǎn)運(yùn)rna(trna)、發(fā)夾rna(hprna)、干擾rna(sirna)、微小rna(mirna)中的任意一種或幾種的組合。

49、具體的，所述綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度的測(cè)定方式為：取相同體積加入酶標(biāo)板用酶標(biāo)儀在激發(fā)光波長(zhǎng)485nm、發(fā)射光波長(zhǎng)526nm下進(jìn)行讀數(shù)，最后再折算至單位od600。

50、具體的，所述木糖還原酶和葡萄糖脫氫酶單位酶活定義為：每毫升樣本每分鐘產(chǎn)生1mmol的nadh定義為一個(gè)酶活力單位。測(cè)定方式為：將發(fā)酵液離心收集菌體，控制同一od600以10ml?pbs懸浮后進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎后離心得到的上清即為粗酶液。以相應(yīng)的底物加入粗酶液反應(yīng)后使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在340nm處進(jìn)行檢測(cè)。

51、所述發(fā)酵，其發(fā)酵培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基或tb培養(yǎng)基；優(yōu)選的，所述tb培養(yǎng)基為降磷tb培養(yǎng)基。若無(wú)特殊說(shuō)明，發(fā)酵培養(yǎng)基一般為降磷tb培養(yǎng)基。

52、其中，所述lb培養(yǎng)基，其配方為：蛋白胨5～15g/l、酵母粉1～5g/l、氯化鈉5～10g/l；所述tb培養(yǎng)基，其配方為：蛋白胨5～15g/l、酵母粉5～30g/l、十二水磷酸氫二鈉5～15g/l、磷酸二氫鉀1～5g/l、甘油1～10ml/l；所述降磷tb培養(yǎng)基配方為：蛋白胨5～15g/l、酵母粉5～30g/l、十二水磷酸氫二鈉5～10g/l、磷酸二氫鉀1～3g/l、甘油1～10ml/l

53、優(yōu)選的，所述lb培養(yǎng)基，其配方為：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l。

54、優(yōu)選的，所述降磷tb培養(yǎng)基，其配方為：蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，十二水磷酸氫二鈉9.4g/l,磷酸二氫鉀2.2g/l，甘油4ml/l。

55、其中，所述lb培養(yǎng)基或降磷tb培養(yǎng)基中包括0.1～20mm?mg2+、0.1～2.0mm?ca2+、0.1％～2％nacl、0.1～200mm山梨醇中的任意一種組分或幾種組分的組合。

56、優(yōu)選的，所述lb培養(yǎng)基或降磷tb培養(yǎng)基中包括1％～2％?nacl、60～160mm山梨醇中的任意一種組分或幾種組分的組合。

57、更優(yōu)選的，所述lb培養(yǎng)基或降磷tb培養(yǎng)基中包括150mm山梨醇。

58、其中，所述發(fā)酵，其發(fā)酵條件為：溫度18～37℃，轉(zhuǎn)速150～250rpm，當(dāng)發(fā)酵至od600＝0.6～0.8時(shí)，加入0.01～2.0mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，總發(fā)酵時(shí)間為8～72h。

59、優(yōu)選的，所述發(fā)酵，其發(fā)酵條件為：溫度20℃，轉(zhuǎn)速200rpm，當(dāng)發(fā)酵至od600＝0.6～0.8時(shí)，加入0.2mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，總發(fā)酵時(shí)間為24h。

60、本發(fā)明還對(duì)過(guò)表達(dá)diviva基因的菌株進(jìn)行了細(xì)胞生理表征，包括細(xì)胞干重、總rna、總蛋白含量測(cè)定等。

61、有益效果：

62、(1)本發(fā)明通過(guò)強(qiáng)化diviva的表達(dá)，能夠有效增大大腸桿菌細(xì)胞的體積和單個(gè)細(xì)胞的表面積，同時(shí)導(dǎo)致總糖、總蛋白含量的變化，為生產(chǎn)一些胞內(nèi)或胞外產(chǎn)物提供了更大的生產(chǎn)空間，提高了生產(chǎn)效率。

63、(2)本發(fā)明通過(guò)強(qiáng)化diviva的表達(dá)并進(jìn)一步強(qiáng)化mine，或弱化mreb、minc、mind、ftsz或daca的表達(dá)，得到了形態(tài)各異的大腸桿菌細(xì)胞，包括細(xì)胞變長(zhǎng)、變寬、變圓、出現(xiàn)分枝，呈現(xiàn)絲狀、蛇狀、啞鈴狀，橢圓形、球形、蝌蚪狀。構(gòu)建出了新的細(xì)胞形態(tài)，增大的細(xì)胞形態(tài)有利于細(xì)胞截留、吸附、沉淀、產(chǎn)物分離等生產(chǎn)新工藝。

64、(3)本發(fā)明提供了一種在重組大腸桿菌中提高蛋白質(zhì)、核酸、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的應(yīng)用，顯著增加了細(xì)胞內(nèi)rna、熒光蛋白、葡萄糖脫氫酶、木糖還原酶和胞苷脫氨酶的表達(dá)量。