本發(fā)明屬于植物外泌體提取，具體涉及一種小球藻外泌體的制備方法及其產(chǎn)品和應用。

背景技術(shù)：

1、小球藻是色球藻目中的常見植物，屬綠藻門，含多種營養(yǎng)成分，可以作為營養(yǎng)補充品服用，具有抗衰老、養(yǎng)顏等功效，其富含維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)，可以完整的修復受損的細胞組織，提高正常細胞的再生能力達到25％以上，幫助肌膚促進膠原帶白和彈力蛋白合成，起到修護和抗老化的作用，還具有強大的抗氧化和清除自由基的功能，使皮膚恢復水潤光澤，因此被越來越多的被用于護膚產(chǎn)品中。

2、cn114805485a公開了一種含有小球藻活性肽的抗衰老的化妝品，是將小球藻粉溶于熱水，溶解后進行高壓萃取，萃取液用木瓜蛋白酶進行酶解，酶解液經(jīng)超濾管進行超濾分離，經(jīng)純化后收集凍干，制備成小球藻活性肽提取物凍干粉。該發(fā)明所提供的小球藻活性肽能夠延緩過度氧化造成的皮膚自然衰老和uv照射造成的皮膚光老化，同時促進細胞增殖，增強皮膚代謝，延緩皮膚衰老。

3、cn110801413a公開了一種小球藻發(fā)酵提取物及其制備方法。該發(fā)明利用植物乳桿菌等菌種的培養(yǎng)液對小球藻粉進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過離心、過濾、除菌，得小球藻粉發(fā)酵提取物。所述方法反應條件溫和，制備工藝簡單，無添加任何化學成分。通過實驗證明，上述方法制備的小球藻粉發(fā)酵提取物，富含蛋白質(zhì)、粗多糖、總氨基酸和葉黃素等功效成分，具良好的抗自由基、改善皮膚刺激及抗衰老等功效，且生物安全性高，可廣泛應用到的各類化妝品中。

4、現(xiàn)有技術(shù)的化妝品中使用的小球藻也越來越多，但鮮有使用小球藻外泌體的，而植物外泌體蘊含了植物中90％的活性成分，并在生物相容性、穩(wěn)定性、體內(nèi)分布、延長半衰期和細胞內(nèi)化等方面都表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，因此，為了更好的發(fā)揮小球藻的功效，急需提供一種小球藻外泌體的制備方法來滿足應用的需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種小球藻外泌體的制備方法及其產(chǎn)品和應用。

2、為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種小球藻外泌體的制備方法，所述制備方法包括：

4、(1)將極微小球藻與分離緩沖液混合后進行破壁處理，得到細胞破碎液；

5、(2)將細胞破碎液離心后保留上清液；

6、(3)將上清液過濾后得到所述小球藻外泌體。

7、本發(fā)明提供的方法以極微小球藻為原材料，然后將極微小球藻與分離緩沖液混合后通過破壁、離心和過濾處理，解決了小球藻外泌體制備過程純度不高的問題，最終得到的含有高水平的蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸等活性成分，不僅可以具有優(yōu)異的保濕抗衰老功效，而且還具有抗炎抗敏功效，可用于敏感肌膚，幫助減少紅腫和刺激現(xiàn)象。

8、優(yōu)選地，所述分離緩沖液包括tris、na2hpo4、nacl、吐溫80、山梨醇和水。

9、優(yōu)選地，所述分離緩沖液以摩爾濃度計包括tris?15-20mm、na2hpo4?20-40mm、nacl1-3mm、吐溫80?0.1-2mm、山梨醇0.1-1mm。

10、例如，所述分離緩沖液中所述tris的摩爾濃度為15-20mm，例如可以為16mm、17mm、18mm或19mm等；

11、所述na2hpo4的摩爾濃度為20-40mm，例如可以為22mm、24mm、26mm、28mm、30mm、32mm、34mm、36mm或38mm等；

12、所述nacl的摩爾濃度為1-3mm，例如可以為1.1mm、1.3mm、1.5mm、1.7mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.7mm或2.9mm等；

13、所述吐溫80的摩爾濃度為0.1-2mm，例如可以為0.3mm、0.5mm、0.7mm、1mm、1.1mm、1.3mm、1.5mm、1.7mm或1.9mm等；

14、所述山梨醇的摩爾濃度為0.1-1mm，例如可以為0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm或0.9mm等。

15、優(yōu)選地，所述分離緩沖液的ph為6-7，例如可以為6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8或6.9等。

16、優(yōu)選地，所述極微小球藻與分離緩沖液的料液比為0.1-0.8g/ml，例如可以為0.2g/ml、0.3g/ml、0.4g/ml、0.5g/ml、0.6g/ml或0.7g/ml等。

17、優(yōu)選地，所述破壁處理時轉(zhuǎn)速為2000-5000rpm，時間為10-20min，溫度為25-35℃。

18、例如轉(zhuǎn)速可以為2500rpm、3000rpm、3500rpm、4000rpm或4500rpm等，時間可以為11min、13min、15min、17min或19min等，溫度可以為26℃、28℃、30℃、32℃或34℃等。

19、優(yōu)選地，步驟(2)所述離心為梯度離心。

20、優(yōu)選地，所述梯度離心的具體步驟為：300-500g(例如可以為320g、350g、380g、400g、420g、450g或480g等)離心5-15min(例如可以為6min、8min、10min、12min或14min等)，1000-2000g(例如可以為1100g、1300g、1500g、1700g或1900g等)離心10-30min(例如可以為12min、14min、16min、18min、20min、22min、24min、26min或28min等)，4000-5000g(例如可以為4100g、4300g、4500g、4700g或4900g等)離心10-30min(例如可以為12min、14min、16min、18min、20min、22min、24min、26min或28min等)，6000-7000g(例如可以為6100g、6300g、6500g、6700g或6900g等)離心10-30min(例如可以為12min、14min、16min、18min、20min、22min、24min、26min或28min等)。

21、優(yōu)選地，步驟(3)所述過濾為濾膜過濾。

22、優(yōu)選地，所述濾膜的孔徑為0.5-1μm，例如可以為0.6μm、0.7μm、0.8μm或0.9μm等。

23、優(yōu)選地，步驟(3)所述過濾后還包括濃縮處理。

24、優(yōu)選地，所述濃縮至過濾液原體積的15-30％，例如可以為16％、18％、20％、22％、24％、26％或28％等。

25、上述各項數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。

26、第二方面，本發(fā)明提供了一種小球藻外泌體，所述小球藻外泌體采用如第一方面所述的方法制備得到。

27、第三方面，本發(fā)明提供了一種如第二方面所述的小球藻外泌體在制備護膚品中的應用。

28、優(yōu)選地，所述護膚品包括凝膠、精華、乳液、面霜、軟膏或面膜中的任意一種。

29、優(yōu)選地，所述小球藻外泌體在所述護膚品中的添加量為0.1-10％，例如可以為0.3％、0.5％、0.8％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％等。

30、上述各項數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。

31、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

32、(1)本發(fā)明提供的小球藻外泌體的制備方法步驟簡單易操作，通過將小球藻原料與特定的分離緩沖液破壁處理，可使制備得到的小球藻中的活性成分更好的被提取出來，進而使得到的外泌體中蛋白質(zhì)和多糖的含量更高，同時制備過程中再輔以梯度離心、濾膜過濾等，可以使制備出的外泌體純度高，雜質(zhì)更少。

33、(2)本發(fā)明的分離緩沖液中tris、na2hpo4、nacl、吐溫80、山梨醇和水配合使用，不僅能為小球藻外泌體制備過程中提供了一個穩(wěn)定的環(huán)境，防止小球藻活性成分在分離過程中受到損害。