本發(fā)明涉及蛋白領域，具體為一種乳鐵蛋白的制備工藝。

背景技術：

1、乳鐵蛋白是一種非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，具有多種生物學功能，在臨床醫(yī)學、基因調(diào)控、食品保健等方面發(fā)揮重要作用。近年來，隨著乳品工業(yè)迅速發(fā)展，乳鐵蛋白廣泛應用于食品、藥品、化妝品等產(chǎn)品中。因此，需要開發(fā)和完善乳鐵蛋白的制備工藝，提取高純度的乳鐵蛋白。

2、乳鐵蛋白大多來源于哺乳動物的乳汁中，特別是初乳中含量最高，然而初乳中含有多種物質(zhì)，如免疫球蛋白、酪蛋白、乳鐵蛋白等，其中酪蛋白的含量最高，占80％，因此，在乳鐵蛋白的制備工藝中首先就要除去酪蛋白，酪蛋白的去除方法主要為等電點法和酶解法，等電點法在去除酪蛋白時，受ph影響較大，導致最終產(chǎn)品的純度受限，酶解后得到的乳清中雖然酪蛋白含量降低，但是也會在乳清中引入新的游離酶雜質(zhì)。

3、去除酪蛋白，收集乳清后，還需要進一步對乳清中的乳鐵蛋白進行分離純化，乳鐵蛋白的分離純化有離子交換色譜法、親和柱層析法、凝膠層析法等，親和柱層析法特異性高，純度高，但成本也高，離子交換色譜法和凝膠層析法普遍存在特異性較低的問題，由此可見，在乳鐵蛋白的制備工藝中，需要一種更高純度、低成本、具有特異性的制備工藝。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種乳鐵蛋白的制備工藝，以解決現(xiàn)有技術中存在的問題。

2、為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供如下技術方案：

3、一種乳鐵蛋白的制備工藝，包括以下制備步驟：

4、(1)將氨基中空介孔二氧化硅、1％的戊二醛水溶液按質(zhì)量比1:(3-4)混合，在室溫下攪拌20-30min，過濾并使用0.01m，ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3-4次，將洗滌后的氨基中空介孔二氧化硅、磷酸鹽緩沖溶液、凝乳酶、殼聚糖按質(zhì)量比1:(10-12):(0.5-0.7):(0.4-0.6)攪拌混勻12-14h，過濾并使用0.01m，ph7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌3-4次，得到改性二氧化硅；

5、(2)使用1mol/l的鹽酸溶液將脫脂牛奶的ph調(diào)節(jié)至6.0-6.2，并在35℃下保溫30min，得到保溫脫脂牛奶，將改性二氧化硅、純水按質(zhì)量比1:(10-12)混勻，在35℃下保溫30min，得到改性二氧化硅分散液，將改性二氧化硅分散液、保溫脫脂牛奶按質(zhì)量比1:(10-12)混合，在50℃下攪拌反應90-100min，在4℃、8000r/min轉(zhuǎn)速下離心，離心時間為15min，收集上清液得到乳清；

6、(3)將4-乙烯基吡啶、乳鐵蛋白、甲醇混合，在30℃下攪拌20-30min，加入預處理樹脂、交聯(lián)劑和引發(fā)劑，在60℃下攪拌聚合，過濾并使用氫氧化鈉-乙醇混合液洗滌3-4次，使用純水洗滌3-4次，得到分子印跡樹脂；

7、(4)將分子印跡樹脂、硫酸銀按質(zhì)量比1:(0.03-0.05)混合，升溫至70℃，滴加分子印跡樹脂質(zhì)量7-9倍的濃度為98％的濃硫酸，滴加速度為2ml/min，升溫至80℃反應30-40min，用玻沙漏斗過濾，浸沒于冰水混合物中，攪拌20min后，過濾并使用純水洗滌6-8次，在60℃下干燥7-8h，得到改性陽離子交換樹脂；

8、(5)將改性陽離子交換樹脂進行活化得到活化改性樹脂，將乳清、活化改性樹脂、純水按質(zhì)量比1:(0.5-0.6):(20-30)混勻，使用1m的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至6.8，在4℃下攪拌12h，攪拌速度100-200r/min，過濾并使用純水洗滌3-4次，放入活化改性樹脂質(zhì)量50-60倍的5wt％的氯化鈉溶液中攪拌10min進行洗脫，得到洗脫液，將洗脫液使用超濾膜進行超濾，超濾膜截留分子量為50kda，超濾3-4次后，冷凍干燥得到乳鐵蛋白。

9、作為優(yōu)化，步驟(2)所述脫脂牛奶的制備工藝為：在4℃，10000r/min條件下使用高速冷凍離心機對牛初乳進行脫脂，離心時間為30min，去除上層脂肪，得到脫脂牛奶；所述牛初乳為乳牛產(chǎn)犢后72h內(nèi)收集。

10、作為優(yōu)化，步驟(3)所述4-乙烯基吡啶、乳鐵蛋白、甲醇、預處理樹脂、交聯(lián)劑和引發(fā)劑的質(zhì)量比為1:(0.2-0.3):(50-60):(5-6):(1-1.2):(0.01-0.02)；所述氫氧化鈉-乙醇混合液是由8wt％的氫氧化鈉溶液和無水乙醇按體積比1:1制得的；所述交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯，引發(fā)劑為過氧化二苯甲酰。

11、作為優(yōu)化，步驟(3)所述預處理樹脂的制備工藝為：將聚苯乙烯類樹脂使用純水清洗3-4次，放入索氏抽提器用無水乙醇抽提6h，抽提結(jié)束后在40℃下干燥6-8h，得到預處理樹脂，所述聚苯乙烯類樹脂型號為：nda-1800樹脂。

12、作為優(yōu)化，步驟(5)所述活化步驟為：將改性陽離子交換樹脂浸沒于90-100℃的純水中靜置1-2h，再浸沒于10％的氯化鈉溶液中30-40min，得到活化改性樹脂。

13、作為優(yōu)化，步驟(1)所述氨基中空介孔二氧化硅粒徑為100nm；所述殼聚糖脫乙酰度為≥95％；所述凝乳酶酶活力為890imcu/g。

14、作為優(yōu)化，步驟(3)所述乳鐵蛋白為天然牛乳鐵蛋白，含量>98％，品牌為美國西爾瑪。

15、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所達到的有益效果是：

16、本發(fā)明在制備乳鐵蛋白時，首先，使用氨基中空介孔二氧化硅同時負載殼聚糖和凝乳酶得到改性二氧化硅；以牛初乳為原料，離心得到脫脂牛奶，使用改性二氧化硅沉淀脫脂牛奶中的酪蛋白，得到乳清；然后，以乳鐵蛋白為模板分子，4-乙烯基吡啶為單體，聚苯乙烯類樹脂為載體，在交聯(lián)劑和引發(fā)劑的作用下制備分子印跡樹脂，對分子印跡樹脂進行磺化得到改性陽離子交換樹脂，再使用改性陽離子交換樹脂對乳清進行分離純化得到乳鐵蛋白。

17、首先，使用氨基中空介孔二氧化硅同時負載殼聚糖和凝乳酶得到改性二氧化硅；以牛初乳為原料，離心得到脫脂牛奶，使用改性二氧化硅沉淀脫脂牛奶中的酪蛋白，得到乳清；凝乳酶是一種蛋白水解酶，作用于酪蛋白，使其發(fā)生結(jié)構變化，失去原有的穩(wěn)定作用，從而在鈣離子的作用下發(fā)生沉淀；殼聚糖的氨基在酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化，使得殼聚糖表面帶上正電荷，酪蛋白在等電點4.6-4.8以上帶有負電荷，殼聚糖上的正電荷可以吸引酪蛋白，和凝乳酶協(xié)同沉淀酪蛋白，同時，殼聚糖具有良好的抗菌性，在牛初乳脫脂除酪蛋白的操作過程中，減少微生物污染的可能；殼聚糖和凝乳酶固定于二氧化硅載體上，在過濾時會和酪蛋白一起去除，不會額外在乳清中引入雜質(zhì)；

18、然后，以乳鐵蛋白為模板分子，4-乙烯基吡啶為單體，聚苯乙烯類樹脂為載體，在交聯(lián)劑和引發(fā)劑的作用下制備分子印跡樹脂，對分子印跡樹脂進行磺化得到改性陽離子交換樹脂，再使用改性陽離子交換樹脂對乳清進行分離純化得到乳鐵蛋白。分子印跡聚合物是以目標分子為模板，具有特異選擇性的一類聚合物，以乳鐵蛋白為模板分子制備的分子印跡樹脂上具有與乳鐵蛋白相匹配的空穴，可以實現(xiàn)對乳鐵蛋白的特異性吸附；將分子印跡樹脂進行磺化使樹脂上帶有強酸性基團，在水中解離后樹脂本體所含的酸性基團可以結(jié)合乳鐵蛋白；改性陽離子交換樹脂上的乳鐵蛋白分子印跡和酸性基團可以協(xié)同吸附乳鐵蛋白，從而提高乳鐵蛋白的純度。