本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種新冠病毒重組嵌合抗原、其相關(guān)產(chǎn)品、制備方法及其在新冠病毒疫苗制備中的應用。

背景技術(shù)：

1、新型冠狀病毒(sars-cov-2)屬于冠狀病毒科β-冠狀病毒屬，是單股正鏈rna囊膜病毒，是能夠廣泛感染人和多種動物的人畜共患病病毒。sars-cov-2冠狀病毒感染最常見的癥狀是發(fā)燒、發(fā)冷和喉嚨痛，但也有一系列其他癥狀。sars-cov-2疫苗能夠有效預防重癥和死亡。雖然人們在接種疫苗后仍有可能感染sars-cov-2，但更有可能出現(xiàn)輕微癥狀或沒有癥狀。

2、sars-cov-2囊膜表面刺突蛋白(spike?protein，s)介導病毒的附著、融合和進入宿主細胞，位于s蛋白c端的受體結(jié)合域(receptor?binding?domain，rbd)被認為是誘導機體產(chǎn)生中和抗體的最主要靶區(qū)域，也是疫苗研發(fā)的重要靶標。rbd作為疫苗免疫原能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體，可有效抑制病毒與受體結(jié)合，從而抑制病毒感染和入侵宿主細胞，因此rbd也被作為新冠疫苗研發(fā)的重要靶點。

3、sars-cov-2的演化出多種流行變異株，主要包括阿爾法，貝塔，伽馬，德爾塔等變異毒株。omicron毒株也進化出一系列的變異毒株，包括ba.1，ba.2，ba.2.75，ba.4/5，bq.1.1，bf.7，xbb，xbb.1.5，xbb.1.16，eg.5，jn.1，ba.2.86，kp.2等。這些新出現(xiàn)的omicron流行變異株，其s蛋白存在大量突變位點，對已有的新冠病毒中和抗體藥物和疫苗激活的體液免疫反應都有嚴重的免疫逃逸。因此，開發(fā)新一代能夠應對多種流行變異株的新型冠狀病毒疫苗的需求迫在眉睫，而針對omicron及其他變異毒株的中和效果則是新一代新型冠狀病毒疫苗的重要指標。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種新冠病毒重組嵌合抗原、其相關(guān)產(chǎn)品、制備方法及其在新冠病毒疫苗制備中的應用。

2、所述重組嵌合抗原為重組新冠病毒奧密克戎(本文中也稱“omicron”)變異株rbd三聚體抗原，基于該重組嵌合抗原或其編碼核酸的重組蛋白疫苗或各類核酸疫苗(特別是后者)針對新冠病毒omicron各亞型變異株能夠均衡地激發(fā)強烈的免疫反應，具有廣譜且較強的免疫原性。

3、具體地，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

4、第一方面，本發(fā)明提供了一種新型冠狀病毒的重組嵌合抗原，所述重組嵌合抗原具有如式(i)所示結(jié)構(gòu)的氨基酸序列：

5、(a-b)-c1-(a-b’)-c2-(a-b”)

6、(i)

7、式(i)中：

8、a-b表示新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域或其一部分的氨基酸序列，或與其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且與其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

9、a-b’表示新型冠狀病毒omicron變異株eg.5亞型s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域或其一部分的氨基酸序列，或與其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且與其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

10、a-b”表示新型冠狀病毒omicron變異株ba.2.86亞型s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域或其一部分的氨基酸序列，或與其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且與其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

11、c1和c2相同或不同，各自獨立地表示連接子(ggs)n；其中，n＝0,1,2,3,4或5。

12、對于上述重組嵌合抗原：

13、作為優(yōu)選，所述新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域的一部分為其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；

14、作為優(yōu)選，所述新型冠狀病毒omicron變異株eg.5亞型s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域的一部分為其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；

15、作為優(yōu)選，所述新型冠狀病毒omicron變異株ba.2.86亞型s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域的一部分為其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；

16、作為優(yōu)選，n＝0,1,2或3。

17、在一些優(yōu)選的具體實施方案中，所述新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域或其一部分的氨基酸序列如seq?id?no:1所示，或者如seq?id?no:1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸獲得的、與其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

18、和/或，所述新型冠狀病毒omicron變異株eg.5亞型s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域或其一部分的氨基酸序列如seq?id?no:2所示，或者如seq?id?no:2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸獲得的、與其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

19、和/或，所述新型冠狀病毒omicron變異株ba.2.86亞型s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域或其一部分的氨基酸序列如seq?id?no:3所示，或者如seq?id?no:3所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸獲得的、與其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

20、和/或，n＝0,1或2。

21、在進一步優(yōu)選的具體實施方案中，a-b表示如seq?id?no:1所示的氨基酸序列，a-b’表示如seq?id?no:2所示的氨基酸序列，a-b”表示如seq?id?no:3所示的氨基酸序列；

22、進一步優(yōu)選地，所述重組嵌合抗原包括如seq?id?no:4所示的氨基酸序列。

23、在可行的實施方案中，所述重組嵌合抗原的n端還包括信號肽序列，優(yōu)選地，所述信號肽序列如seq?id?no:5所示；并且/或者，所述重組嵌合抗原的c端還包括標簽序列，優(yōu)選地，所述標簽為6×his標簽。在可行的具體實施方案中，所述重組嵌合抗原包括如seq?idno:6所示的氨基酸序列。

24、第二方面，本發(fā)明提供了如上述第一方面所述的重組嵌合抗原的制備方法，其包括以下步驟：

25、在編碼如上所述重組嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加上kozak序列和任選地信號肽的編碼序列，3’端加上任選地組氨酸標簽的編碼序列和終止密碼子，進行克隆表達，篩選正確的重組子，然后將其轉(zhuǎn)染表達系統(tǒng)細胞進行表達，收集細胞培養(yǎng)上清，從中分離獲得所述重組嵌合抗原。

26、在可行的實施方案中，所述表達系統(tǒng)細胞為哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或細菌細胞；

27、可選地，所述哺乳動物細胞為hek293t細胞、293f系列細胞或cho細胞；進一步可選地，所述293f系列細胞為hek293f細胞、freestyle293f細胞或expi293f細胞；

28、可選地，所述昆蟲細胞為sf9細胞、hi5細胞、sf21細胞或s2細胞；

29、可選地，所述酵母細胞為畢赤酵母細胞或者由其改造的酵母細胞；

30、可選地，所述細菌細胞為大腸桿菌細胞。

31、第三方面，本發(fā)明提供了一種多核苷酸，其編碼如上述第一方面所述的重組嵌合抗原。

32、所述多核苷酸為經(jīng)人源密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，可以為dna或mrna；

33、在一些實施方案中，所述多核苷酸為dna分子，優(yōu)選地，所述dna分子包括如seq?idno:7或8所示的dna序列；其中，如seq?id?no:7所示的dna序列編碼氨基酸序列如seq?idno:4所示的重組嵌合抗原(不包括信號肽和標簽序列)，如seq?id?no:8所示的dna序列編碼氨基酸序列如seq?id?no:6所示的重組嵌合抗原(包括信號肽和標簽序列)。

34、在另一些實施方案中，所述多核苷酸為mrna分子，優(yōu)選地，所述mrna分子包括如seq?id?no:9或10所示的mrna序列；其中，如seq?id?no:9所示的mrna序列為如seq?id?no:7所示的dna序列的對應序列，編碼如seq?id?no:4所示的重組嵌合抗原(不包括信號肽和標簽序列)；如seq?id?no:10所示的mrna序列為如seq?id?no:8所示的dna序列的對應序列，編碼氨基酸序列如seq?id?no:6所示的重組嵌合抗原(包括信號肽和標簽序列)。

35、第四方面，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸，以及任選地，與所述多核苷酸可操作地連接的至少一個表達調(diào)控元件。

36、第五方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，其包含如上述第四方面所述的核酸構(gòu)建體。

37、第六方面，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，其中轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸構(gòu)建體或如上述第五方面所述的表達載體。

38、第七方面，本發(fā)明提供了如上述第一方面所述的重組嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸構(gòu)建體、如上述第五方面所述的表達載體或如上述第六方面所述的宿主細胞在制備用于預防和/或治療新型冠狀病毒感染的疫苗中的應用。

39、優(yōu)選地，所述新型冠狀病毒為選自以下的一種或多種：sars-cov-2原始毒株，sars-cov-2變異毒株alpha(b.1.1.7)、beta(b.1.351)、gamma(p.1)、kappa(b.1.617.1)、delta(b.1.617.2)、omicron亞型ba.1、ba.1.1、ba.2、ba.2.12.1、ba.3、ba.4、ba.5、xbb、eg.5、ba.2.86、jn.1、kp.2；

40、優(yōu)選地，所述疫苗用于單獨免疫或者與其他類型的新型冠狀病毒疫苗進行序貫免疫；進一步優(yōu)選地，所述其他類型的新型冠狀病毒疫苗為滅活疫苗。

41、第八方面，本發(fā)明提供了一種疫苗或免疫原性組合物，其包含如上述第一方面所述的重組嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸構(gòu)建體、如上述第五方面所述的表達載體或如上述第六方面所述的宿主細胞，以及生理學可接受的媒介物、佐劑、賦形劑、載體和/或稀釋劑。

42、在一個優(yōu)選的具體實施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物為新型冠狀病毒重組蛋白疫苗，其包括如上述第一方面所述的重組嵌合抗原和佐劑；

43、可選地，所述佐劑為選自以下佐劑中的一種或多種：鋁佐劑、mf59佐劑和類mf59佐劑；進一步可選地，所述佐劑為類mf59佐劑；更進一步可選地，所述佐劑為addavax。

44、在另一個優(yōu)選的具體實施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物為新型冠狀病毒dna疫苗，其包括：

45、(1)真核表達載體；和

46、(2)構(gòu)建入所述真核表達載體中的、編碼如上述第一方面所述的重組嵌合抗原的dna序列，優(yōu)選為如seq?id?no:7或8所示的dna序列；

47、可選地，所述真核表達載體選自pgx0001、pvax1、pcaggs和pcdna系列載體。

48、在另一個優(yōu)選的具體實施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物為新型冠狀病毒mrna疫苗，所述mrna疫苗包括：

49、(i)編碼如上述第一方面所述的重組嵌合抗原的mrna序列，優(yōu)選為如seq?id?no:9或10所示的mrna序列；和

50、(ii)脂質(zhì)納米顆粒。

51、在另一個優(yōu)選的具體實施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物為新型冠狀病毒-病毒載體疫苗，其包括：

52、(1)病毒骨架載體；和

53、(2)構(gòu)建入所述病毒骨架載體中的、編碼如上述第一方面所述的重組嵌合抗原的dna序列，優(yōu)選為如seq?id?no:7或8所示的dna序列；

54、可選地，所述病毒骨架載體選自以下病毒載體中的一種或幾種：腺病毒載體、痘病毒載體、流感病毒載體、腺相關(guān)病毒載體。

55、在另一個優(yōu)選的具體實施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物為新型冠狀病毒納米顆粒疫苗；

56、優(yōu)選地，所述納米顆粒的載體為鐵蛋白，如上述第一方面所述的重組嵌合抗原與鐵蛋白共價連接并自組裝成納米顆粒，使得所述重組嵌合抗原呈現(xiàn)于納米顆粒的表面；進一步優(yōu)選地，所述重組嵌合抗原與鐵蛋白通過linker連接，或者通過spytag/spycatcher連接體系共價連接。

57、在可行的實現(xiàn)方式中，所述疫苗或免疫原性組合物為鼻噴劑、口服制劑、栓劑或胃腸外制劑的形式；

58、優(yōu)選地，所述鼻噴劑選自氣霧劑、噴霧劑和粉霧劑；

59、優(yōu)選地，所述口服制劑選自片劑、粉末劑、丸劑、顆粒劑、軟/硬膠囊劑、薄膜包衣劑和膏劑；

60、進一步優(yōu)選地，所述片劑為舌下片；

61、進一步優(yōu)選地，所述顆粒劑為細粒劑；

62、進一步優(yōu)選地，所述粉末劑為散劑；

63、進一步優(yōu)選地，所述丸劑為小丸劑；

64、優(yōu)選地，所述胃腸外制劑為經(jīng)皮劑、軟膏劑、硬膏劑、外用液劑、可注射制劑；進一步優(yōu)選地，所述可注射制劑為可推注制劑。

65、第九方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包括如上述第八方面所述的疫苗或免疫原性組合物，以及任選地其他類型的新型冠狀病毒疫苗，所述疫苗或免疫原性組合物與所述其他類型的新型冠狀病毒疫苗單獨包裝；

66、優(yōu)選地，所述其他類型的新型冠狀病毒疫苗為新型冠狀病毒滅活疫苗。

67、第十方面，本發(fā)明提供了一種預防和/或治療新冠病毒感染的方法，所述方法包括：向有需要的受試者施用預防和/或治療有效量的以下物質(zhì)：如上述第一方面所述的重組嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸構(gòu)建體、如上述第五方面所述的表達載體、如上述第六方面所述的宿主細胞和/或如上述第八方面所述的疫苗或免疫原性組合物。

68、可行地，所述新冠病毒為選自以下的一種或多種：sars-cov-2原始毒株，sars-cov-2變異毒株alpha(b.1.1.7)、beta(b.1.351)、gamma(p.1)、kappa(b.1.617.1)、delta(b.1.617.2)、omicron亞型ba.1、ba.1.1、ba.2、ba.2.12.1、ba.3、ba.4、ba.5、xbb、eg.5、ba.2.86、jn.1、kp.2。

69、所述“預防和/或治療有效量”可根據(jù)給藥對象、對象臟器、癥狀、給藥方法等不同而存在差異，可以考慮劑型的種類、給藥方法、患者的年齡和體重、患者的癥狀等，根據(jù)醫(yī)生的判斷來確定。

70、有益效果

71、本發(fā)明提供了一種由新冠病毒omicron變異株xbb.1.5亞型、eg.5亞型和ba.2.86亞型的s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的重組嵌合抗原、編碼其的多核苷酸以及基于該重組嵌合抗原或其編碼核酸的各類型疫苗產(chǎn)品?；谠撝亟M嵌合抗原或其編碼核酸的疫苗產(chǎn)品針對新冠病毒omicron變異株的各亞型(包括ba.1、ba.2、ba.5、xbb、eg.5、ba.2.86、jn.1和kp.2等)均能夠激發(fā)出強烈的免疫反應，說明其對omicron各亞型均具有很好的免疫保護效應。特別是，基于該重組嵌合抗原的編碼核酸的核酸疫苗(特別是mrna疫苗)與其相應的蛋白疫苗相比可誘發(fā)機體產(chǎn)生更高的rbd特異性結(jié)合抗體滴度和針對多種新冠病毒假病毒的中和抗體效價，因此，可作為新一代新冠病毒疫苗的候選，具有潛在的臨床應用價值和前景。