本發(fā)明屬于蛋白工程，尤其涉及金屬硫蛋白重組載體、重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、碳水化合物是參與許多生命過程的生物分子。碳水化合物活性酶中提供碳水化合物結(jié)合親和力的區(qū)域稱為碳水化合物結(jié)合模塊(cbm)，cbm是研究蛋白質(zhì)-碳水化合物識(shí)別機(jī)制的優(yōu)秀模型系統(tǒng)。

2、金屬硫蛋白(metallothioneins，mts)廣泛存在于各種生物體中，是一類富含半胱氨酸(cys)可被鎘、銅、鋅、鉛或汞等金屬誘導(dǎo)表達(dá)的低分子量蛋白。

3、cbm和金屬硫蛋白結(jié)合構(gòu)成融合蛋白能夠用于構(gòu)建纖維素基復(fù)合型重金屬吸附劑。但是cbm和金屬硫蛋白的融合蛋白采用基因工程的手段制備，表達(dá)量有待進(jìn)一步提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供金屬硫蛋白重組載體、重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明的重組載體能夠提高cbm和金屬硫蛋白的融合蛋白的表達(dá)量。

2、本發(fā)明提供了重組載體，插入有編碼融合蛋白的核酸分子；所述融合蛋白包括自c端至n端順次連接的cbm和金屬硫蛋白；所述金屬硫蛋白包括mtt1、mtt5、tm1或tm2；所述mtt1的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述mtt5的氨基酸序列如seq?id?no.2所示；所述tm1的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；所述tm2的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；所述cbm的氨基酸序列如seq?id?no.5所示；所述重組載體的骨架質(zhì)粒包括pet-28a-sumo、pgex-6p-1或pgex-4t-1。

3、優(yōu)選的，當(dāng)所述金屬硫蛋白為mtt1時(shí)，所述重組載體的骨架質(zhì)粒包括pgex-6p-1；當(dāng)所述金屬硫蛋白為mtt5時(shí)，所述重組載體的骨架質(zhì)粒包括pet-28a-sumo；當(dāng)所述金屬硫蛋白為tm1和/或tm2時(shí)，所述重組載體的骨架質(zhì)粒包括pet-28a-sumo和/或pgex-4t-1。

4、優(yōu)選的，所述核酸分子在重組載體上的插入位點(diǎn)包括限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和xhoⅰ酶切位點(diǎn)。

5、本發(fā)明還提供了宿主細(xì)胞，包含上述方案所述的重組載體。

6、優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞的原始細(xì)胞包括大腸桿菌。

7、本發(fā)明還提供了融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：對(duì)上述方案所述的宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)物；所述融合蛋白包括自c端至n端順次連接的cbm和金屬硫蛋白；所述金屬硫蛋白包括mtt1、mtt5、tm1或tm2；所述mtt1的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述mtt5的氨基酸序列如seq?id?no.2所示；所述tm1的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；所述tm2的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；所述cbm的氨基酸序列如seqid?no.5所示。

8、優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的誘導(dǎo)劑包括iptg；所述iptg的工作濃度包括0～0.2mmol/ml。

9、優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為16～37℃。

10、本發(fā)明還提供了上述方案所述的重組載體、所述的宿主細(xì)胞或者所述制備方法在制備纖維素基復(fù)合型重金屬吸附劑中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明還提供了上述方案所述的重組載體、所述的宿主細(xì)胞或者所述制備方法在重金屬吸附或重金屬污染治理中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明提供了重組載體，插入有編碼融合蛋白的核酸分子；所述融合蛋白包括自c端至n端順次連接的cbm和金屬硫蛋白；所述金屬硫蛋白包括mtt1、mtt5、tm1或tm2；所述重組載體的骨架質(zhì)粒包括pet-28a-sumo、pgex-6p-1或pgex-4t-1。本發(fā)明通過選擇合適的重組載體的骨架質(zhì)粒，能夠提高cbm和金屬硫蛋白的融合蛋白的表達(dá)量。

技術(shù)特征：

1.重組載體，其特征在于，插入有編碼融合蛋白的核酸分子；所述融合蛋白包括自c端至n端順次連接的cbm和金屬硫蛋白；所述金屬硫蛋白包括mtt1、mtt5、tm1或tm2；所述mtt1的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述mtt5的氨基酸序列如seq?id?no.2所示；所述tm1的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；所述tm2的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；所述cbm的氨基酸序列如seq?id?no.5所示；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于，當(dāng)所述金屬硫蛋白為mtt1時(shí)，所述重組載體的骨架質(zhì)粒包括pgex-6p-1；當(dāng)所述金屬硫蛋白為mtt5時(shí)，所述重組載體的骨架質(zhì)粒包括pet-28a-sumo；當(dāng)所述金屬硫蛋白為tm1和/或tm2時(shí)，所述重組載體的骨架質(zhì)粒包括pet-28a-sumo和/或pgex-4t-1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組載體，其特征在于，所述核酸分子在重組載體上的插入位點(diǎn)包括限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和xhoⅰ酶切位點(diǎn)。

4.宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的重組載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞的原始細(xì)胞包括大腸桿菌。

6.融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的誘導(dǎo)劑包括iptg；所述iptg的工作濃度包括0～0.2mmol/ml。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為16～37℃。

9.權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的重組載體、權(quán)利要求4或5所述的宿主細(xì)胞或者權(quán)利要求6～8任意一項(xiàng)所述制備方法在制備纖維素基復(fù)合型重金屬吸附劑中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的重組載體、權(quán)利要求4或5所述的宿主細(xì)胞或者權(quán)利要求6～8任意一項(xiàng)所述制備方法在重金屬吸附或重金屬污染治理中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了金屬硫蛋白重組載體、重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于蛋白工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了重組載體，插入有編碼融合蛋白的核酸分子；所述融合蛋白包括自C端至N端順次連接的CBM和金屬硫蛋白；所述金屬硫蛋白包括MTT1、MTT5、TM1或TM2；所述重組載體的骨架質(zhì)粒包括pET?28a?SUMO、pGEX?6P?1或pGEX?4T?1。本發(fā)明通過選擇合適的重組載體的骨架質(zhì)粒，能夠提高融合蛋白的表達(dá)量，融合蛋白通過與纖維素的結(jié)合，能夠去除重金屬離子。

技術(shù)研發(fā)人員：王偉,趙旭升,許靜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山西大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30