本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料，涉及一種微流控血管芯片，尤其涉及一種用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片及制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、川崎病(kawasaki?disease，kd)又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，是以全身血管炎為主要病變的急性發(fā)熱出疹性疾病，冠狀動(dòng)脈病變是川崎病的主要并發(fā)癥，也是影響其預(yù)后的關(guān)鍵因素。然而，部分兒童川崎病臨床表現(xiàn)往往不典型，達(dá)不到完全性川崎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，常導(dǎo)致醫(yī)生無法確診，故漏診情況時(shí)有發(fā)生，由此導(dǎo)致治療延遲、冠脈并發(fā)癥明顯升高。因此，如何盡早的識(shí)別不完全川崎病、減少患兒漏診甚至誤診，是目前川崎病臨床亟待解決的問題之一。

2、目前，生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域尚未出現(xiàn)專用于川崎病研究的準(zhǔn)確的體外模型，現(xiàn)存川崎病模型僅靠動(dòng)物模型和平面細(xì)胞培養(yǎng)。眾所周知，動(dòng)物模型存在很大的倫理爭議，以及種屬差異，因基因和遺傳背景不同導(dǎo)致很多在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)的致病機(jī)制或有效的藥物，在應(yīng)用于臨床后無效或作用甚微；而傳統(tǒng)的平面細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)被證實(shí)無法模擬人體復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境，尤其是無法重現(xiàn)血管的流體力學(xué)等特征。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片及制備方法、應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片的制備方法，包括以下步驟：步驟一、制備含有膠原通道的微流控芯片；步驟二、在膠原通道內(nèi)種植hcasmcs(原代人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞)，待hcasmcs匯合成單層覆蓋膠原通道后，再種植huvecs(原代人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)，使huvecs匯合成單層覆蓋hcasmcs表面，然后動(dòng)態(tài)灌注(即不斷灌入)培養(yǎng)基，得到所述微流控血管芯片。

4、進(jìn)一步地，步驟一中，所述微流控芯片的制備方法為：通過刻蝕得到pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)模板，通過倒模法得到pdms(聚二甲基硅氧烷)芯片；pdms和固化劑的質(zhì)量比為10∶1，固化溫度為70℃，固化時(shí)間為3h；pdms芯片具有開口朝上的膠原凹槽，膠原凹槽的兩側(cè)具有開口朝向膠原凹槽內(nèi)的打孔凹槽；將針從pdms芯片的側(cè)面插入，使其置于兩個(gè)打孔凹槽和之間的膠原凹槽中，打孔凹槽的底部低于膠原凹槽的底部，因此置于打孔凹槽中的針在膠原凹槽中處于懸空狀態(tài)；向打孔凹槽內(nèi)灌入pdms，待其凝固后將針拔出，形成通道；在通道的上方打孔，形成與兩個(gè)通道連通的入口和出口，將兩個(gè)儲(chǔ)液池固定在入口和出口處；再次將針從pdms芯片的側(cè)面通過通道插入膠原凹槽，然后灌入膠原溶液，固化后即得到所述含有膠原通道的微流控芯片。

5、進(jìn)一步地，步驟一中，所述膠原通道由膠原溶液固化形成；膠原溶液為鼠尾i型膠原溶液，濃度為6～8mg/ml，固化溫度為35～40℃，固化時(shí)間為30～60min；膠原通道的直徑為200～500μm。

6、進(jìn)一步地，步驟二中，所述hcasmcs和huvecs通過翻轉(zhuǎn)種植法進(jìn)行種植；具體方法為：注入細(xì)胞后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min，然后再次注入同種細(xì)胞，將芯片翻轉(zhuǎn)180°后繼續(xù)培養(yǎng)30min。hcasmcs匯合成單層的時(shí)間為24h，huvecs匯合成單層的時(shí)間為48h；hcasmcs的種植濃度為15～25萬/ml，huvecs的種植濃度為25～35萬/ml。

7、進(jìn)一步地，步驟二中，所述培養(yǎng)基包括hcasmcs完全培養(yǎng)基和huvecs完全培養(yǎng)基；hcasmcs完全培養(yǎng)基和huvecs完全培養(yǎng)基的體積比為1∶1；通過泵并經(jīng)由微流控芯片入口的儲(chǔ)液池動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)基；培養(yǎng)基的灌注速度為1～3μl/min，灌注時(shí)間為48h以上。

8、第二方面，本發(fā)明提供上述的制備方法制得的用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片。

9、第三方面，本發(fā)明提供上述的微流控血管芯片在制備診斷不完全川崎病診產(chǎn)品中的應(yīng)用。

10、第四方面，本發(fā)明提供上述的微流控血管芯片在構(gòu)建不完全川崎病病理模型中的應(yīng)用。

11、第五方面，本發(fā)明提供一種不完全川崎病病理模型的構(gòu)建方法，在上述的微流控血管芯片中動(dòng)態(tài)灌注含有不完全川崎病患者血清的培養(yǎng)基；所述含有不完全川崎病患者血清的培養(yǎng)基為將hcasmcs完全培養(yǎng)基和huvecs完全培養(yǎng)基中的血清替換為不完全川崎病患者血清的培養(yǎng)基；灌注速度為40～60μl/min，灌注時(shí)間為4h以上。

12、第五方面，本發(fā)明提供上述的微流控血管芯片在篩選治療不完全川崎病藥物中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明的有益效果在于：

14、一、本發(fā)明提供的用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片為“一字型”微流控芯片，方法簡單，制備方便。采用管狀結(jié)構(gòu)作為搭建hcasmcs和huvecs三維共培養(yǎng)體系的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，并通過引入循環(huán)微泵系統(tǒng)(用于動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)基的含泵裝置)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)，更真實(shí)地模擬人體血管的結(jié)構(gòu)和生理特征，避免了因種屬不同產(chǎn)生的差異以及平面靜態(tài)培養(yǎng)不能很好模擬體內(nèi)環(huán)境的不足。

15、二、本發(fā)明提供的用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片，具有由鼠尾i型膠原制備的管狀通道，為仿生血管組織的構(gòu)建提供接近在體的胞外基質(zhì)環(huán)境，且鼠尾i型膠原具有廣泛的彈性范圍，能夠很好地模擬體內(nèi)血管的彈性模量，更準(zhǔn)確地反映川崎病冠狀動(dòng)脈血管病變的物理變化。

16、三、本發(fā)明提供的用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片可用于川崎病體外疾病模型的構(gòu)建，以及對(duì)不完全川崎病進(jìn)行體外診斷和藥物篩選，為不完全川崎病的臨床科學(xué)研究提供可靠的工具。

技術(shù)特征：

1.一種用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片的制備方法，其特征在于：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片的制備方法，其特征在于：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片的制備方法，其特征在于：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片的制備方法，其特征在于：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片的制備方法，其特征在于：

6.如權(quán)利要求1～5任意一項(xiàng)所述的制備方法制得的用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片。

7.如權(quán)利要求6所述的微流控血管芯片在制備診斷不完全川崎病診產(chǎn)品中的應(yīng)用。

8.如權(quán)利要求6所述的微流控血管芯片在構(gòu)建不完全川崎病病理模型中的應(yīng)用。

9.一種不完全川崎病病理模型的構(gòu)建方法，其特征在于：在如權(quán)利要求6所述的微流控血管芯片中動(dòng)態(tài)灌注含有不完全川崎病患者血清的培養(yǎng)基；

10.如權(quán)利要求6所述的微流控血管芯片在篩選治療不完全川崎病藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于不完全川崎病診斷的微流控血管芯片及制備方法、應(yīng)用，屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，制備方法包括：步驟一、制備含有膠原通道的微流控芯片；步驟二、在膠原通道內(nèi)種植HCASMCs，待HCASMCs匯合成單層覆蓋膠原通道后，再種植HUVECs，使HUVECs匯合成單層覆蓋HCASMCs表面，然后動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)基，得到所述微流控血管芯片。本發(fā)明能夠有效模擬血管的組織結(jié)構(gòu)，且通過對(duì)細(xì)胞連續(xù)的動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)模擬血管的血液流動(dòng)。在實(shí)際應(yīng)用中，通過向微流控血管芯片內(nèi)注入待診斷的血清，觀察膠原通道的物理變化和細(xì)胞炎性反應(yīng)抗體的改變，即可對(duì)不完全川崎病做出診斷。本發(fā)明為川崎病的診斷和治療提供全新的思路和技術(shù)平臺(tái)，可以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行不完全川崎病的篩查。

技術(shù)研發(fā)人員：褚茂平,邵長敏,王言可,榮星,牛超,賈嘗,孫佳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26